清心安神丸質量標準研究

楊 琳，王海峰，張 紅，黨秋萍

1.陜西省楊凌示范區醫院(楊凌 712100)；2.武警陜西總隊醫院(西安 710054)；3.陜西省中醫藥研究院(西安 710003)

清心安神丸源于陜西省中醫醫院中醫內科協定處方，主要由黃連、川芎、梔子等14味藥物組成，有較好的寧心除煩，養陰安神療效。方中黃連清熱燥濕、川芎活血行氣止痛、梔子瀉火除煩，是除煩安神的主藥[1-3]。為了控制好制劑質量，確保其臨床療效，我們對其分別進行了定性定量分析，為清心安神丸的質量控制提供了參考。

資料與方法

1 儀 器 Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ,1260VWD檢測器，Control Panel工作站，超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)、電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，d=0.1 mg、d=0.01 mg)。

2 試 藥 清心安神丸(陜西省中醫醫院制備，批號：180401、180402、180403)；黃連、川芎、梔子苷(均購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：120913-201310、120918-201110、110713-201212、110749-201718)；甲醇購自Fisher公司，其它試劑購自國藥集團，制劑所用藥材購自陜西省中醫醫院藥劑科。

3 薄層色譜鑒別

3.1 黃連：取本清心安神丸樣品4 g，研細，加甲醇30 ml，超聲提取30 min，濾過，濾液作為供試品溶液[4-7]。再按上述方法制備缺黃連的陰性對照溶液。對照品采用黃連對照藥材：黃連對照藥材溶液(取樣量為0.25 g)，按上述方法制備。取上述3種溶液，點于硅膠G板上，點樣量為2 μl，展開劑為：環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)，展開前用濃氨溶液預飽和20 min，紫外光燈(365 nm)下檢視。結果：清心安神丸樣品色譜中檢出黃連，陰性對照無干擾(圖1)。

3.2 川芎：取本清心安神丸樣品6 g，研成細粉，加乙醚30 ml，加熱回流1 h，濾過，揮干乙醚，殘渣加乙酸乙酯2 ml使溶解，作為供試品溶液[8-9]。再按上述方法制備缺川芎的陰性對照溶液，另取川芎對照藥材1 g，按上述方法制成川芎對照藥材溶液。分別吸取樣品溶液、陰性對照溶液和對照藥材溶液各10 μl，點于硅膠G薄層板上，展開劑：正己烷-乙酸乙酯(3∶1)，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結果清心安神丸供試品色譜中檢出川芎，陰性對照無干擾(圖2)。

3.3 梔子：取本清心安神丸樣品13 g，粉碎成細粉，至錐形瓶中，加甲醇40 ml超聲20 min，放涼濾過，濾液水浴蒸干，加水20 ml溶解，用水飽和的正丁醇提取，蒸干，加無水乙醇適量溶解后與3 g中性氧化鋁拌勻，加于中性氧化鋁柱頂(內徑d=1 cm，長12 cm)，用30 ml甲醇洗脫，收集，水浴蒸干，加1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液[10-12]。再按上述方法制備缺梔子的陰性對照溶液。以梔子苷對照品甲醇溶液(4 mg /1 ml)為對照。分別取樣品溶液、陰性對照溶液、對照品溶液各2 μl，點于硅膠G薄層板，展開劑：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)溶液置于冰箱中，冷藏過夜，取下層溶液作為展開劑展開，顯色劑用10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色至斑點清晰。結果顯示，清心安神丸供試品色譜中檢出梔子苷，陰性對照無干擾(圖3)。

4 HPLC法測定梔子苷含量

4.1 梔子苷對照品溶液：精密稱取梔子苷對照品5.1 mg，加100 ml甲醇溶解(0.051 mg/ml)，備用。

4.2 樣品及陰性對照品溶液：取清心安神丸適量，粉碎成細粉，精密稱取1.25 g，置錐形瓶中，精密加甲醇40 ml超聲20 min，放涼后用甲醇補重，搖勻濾過，精密量取10 ml續濾液，水浴蒸至約1 ml，與1 g中性氧化鋁拌勻，干燥，加于中性氧化鋁柱頂(內徑d=1 cm，長12 cm)，以70%甲醇50 ml洗脫，收集，水浴蒸干，加甲醇轉移至10 ml容量瓶中，加溶劑至刻度，搖勻濾過備用。同法制備陰性樣品溶液。

4.3 色譜條件：Kromasil C18色譜柱；流動相：甲醇-水(30∶70)；流速為1.0 ml/min；檢測波長：238 nm。理論塔板數按梔子苷峰計算大于3000[13]。

4.4 陰性對照實驗：分別取樣品溶液、陰性對照溶液、對照品溶液各10 μl，按上述色譜條件檢測，結果：清心安神丸樣品HPLC圖譜中，梔子苷色譜峰分離良好，陰性對照無干擾(圖4-6)。

結 果

1 線性關系考察 精密量取上述梔子苷對照品溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10 μl，測定。結果：梔子苷在 0.102～0.510 μg范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=2147.2X-0.2277，r =0.9999(Y：峰面積，X：進樣量)。

2 精密度試驗 取上述梔子苷對照品溶液10 μl，濃度為0.051 mg/ml，重復進樣6次，結果梔子苷峰面積RSD為0.79%。

3 重現性試驗 上述供試品溶液，在上述色譜條件下測定，測得梔子苷含量RSD為1.23%，表明該方法重現性良好，在樣品中含量為0.5049 mg/g。

4 穩定性試驗 取新制備的供試品溶液10 μl，測定10 h內穩定性(每隔2 h測定1次)，結果梔子苷峰面積RSD在10 h內為0.595%。

5 加樣回收率試驗 精密稱取清心安神丸(含量為0.505 mg/g)細粉六份，每份約0.6 g，分別加入梔子苷對照品溶液(0.051 mg/ml)4.8、4.8、6、6、7.2、7.2 ml，按樣品溶液制備方法處理，測定，結果見表1。

表1 梔子苷回收率試驗結果(n=6)

6 樣品測定 取三批樣品，按上述樣品制備方法處理樣品，測定結果見表2。

表2 清心安神丸樣品含量測定結果(mg/g)

討 論

黃連的薄層鑒別試驗，黃連藥材中含有[14]：①生物堿類：黃連堿、巴馬丁、藥根堿、小檗堿、表小檗堿等生物堿類，在黃連總生物堿中含量高達80%左右，主要是原小檗堿型，其中小檗堿為黃連主要成分。還有一些生物堿類只存在于少量的品種中，并且含量不高，比如甲基黃連堿、木蘭堿等。②脂類：從黃連植物中分離得到了反式阿魏酸對羥基苯乙酯和落葉松脂素。③多糖類。鹽酸小檗堿是黃連藥材中主要有效成分，因此以黃連、鹽酸小檗堿為對照，對方中黃連進行鑒別。按正文方法進行試驗，供試品色譜中，各斑點顯色清晰，分離度良好，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；再按處方比例和樣品制備工藝制成缺黃連陰性對照樣品，按正文方法進行試驗，結果陰性對照未見干擾，故將該方法收入標準正文。

川芎的薄層鑒別試驗，川芎藥材中含有[15]：①揮發性成分：藁本內酯(Ligustilide，58.00%)、3-丁叉苯酞(3-butylidene,phthalide，5.29%)香檜烯(Sabinene，6.08%)，其它成分有：α-蒎烯(α-Pinene)、莰烯(Camphene)、月桂烯(Myrcene)。②苯肽衍生物：川芎內酯(Cnidiumlactone)，川芎酚(Chuanxingol)。③雙苯肽衍生物：﹙Z，Z′﹚-二藁本內酯[(Z，Z′)-diligustilide]等。④生物堿：川芎嗪(Chuanxiongzine)，佩洛立靈(Perlolyrine)，腺嘌呤和腺苷。⑤有機酸類：阿魏酸、棕櫚酸、葉酸、咖啡酸、原二茶酸、香草酸等。⑥有機酸酯類：苯乙酸甲酯、瑟丹酸內酯、十五酸甲酯。川芎藥材成分復雜，特征性成分不明顯。因此以川芎藥材為對照，對方中川芎進行鑒別。按正文方法進行試驗，供試品色譜中，各斑點顯色清晰，分離度良好，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；再按處方比例和樣品制備工藝制成缺川芎陰性對照樣品，按正文方法進行試驗，結果陰性對照未見干擾，故將該方法收入標準正文。

梔子的薄層鑒別試驗，梔子藥材中含有[16]：①環烯醚萜類，如梔子苷,京尼平苷(Geniposide)、京尼平龍膽二糖苷(Genipingentiobioside)、京尼平苷酸(Geniposidic acid)；②西紅花苷類，如西紅花苷，西紅花酸；③另外還含有黃酮類成分。梔子苷是梔子藥材中主要有效成分，因此以梔子苷為對照，對方中梔子進行鑒別。方法一：參照(《中國藥典》2015年版一部)梔子鑒別項下的方法，取本品13 g，研細，加50%甲醇20 ml，超聲處理40 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取供試品溶液6 μl，對照品溶液2 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑,展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，略顯相同顏色的斑點，且分離度不理想。方法二：參照(《中國藥典》2015年版一部)瀉肝安神丸鑒別梔子項下的方法，即正文方法。按正文方法進行試驗，供試品色譜中，各斑點顯色清晰，分離度良好，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；再按處方比例和樣品制備工藝制成缺梔子陰性對照樣品，按正文方法進行試驗，結果陰性對照未見干擾，故將該方法收入標準正文。

含量測定指標選擇：在清心安神丸含量測定之前，對指標的選定進行了預實驗，首先對處方中的君藥生地黃、臣藥梔子的含量測定指標進行了篩選，結果發現生地黃中梓醇成分由于保留時間過小(在5 min以內)，無法與樣品中雜質峰分開，故不能用作質量控制指標。梔子為臣藥，梔子苷含量測定經預試發現流動相簡單，樣品分離度好，峰形理想。故最終選擇梔子藥材中的梔子苷作為制劑質量控制指標。

色譜條件選擇：梔子為方中臣藥，梔子苷為其主要

有效成分，因此采用HPLC法建立其含量測定方法，檢測波長采用《中國藥典》中“梔子”項下波長，流動相采用甲醇與水溶液，對比例進行反復調整，以拖尾因子、分離度、理論塔板數、基線作為評判標準，最終選取甲醇-水(30∶70)為流動相[17]。并進行方法學考察，結果顯示，精密度、重現性及回收率均良好，樣品在10 h內穩定，可用于清心安神丸中梔子苷的檢測標準。

提取溶劑選擇：考察60%、70%、80%甲醇作為洗脫劑時梔子苷的含量分別為0.4646、0.4937、0.4942 mg/g。由此可見用80%甲醇洗脫和用70%甲醇洗脫梔子苷得量差別不大，故選擇用70%甲醇洗脫。

綜上所述，本研究建立了清心安神丸中黃連、川芎、梔子的TLC鑒別方法，并對該制劑中梔子苷含量進行測定并對方法學進行了考察。本研究所建立定性定量鑒別方法簡單，專屬性、耐用性好，可用于清心安神丸的質量控制。