不同pH值下銻(V)對大麥根伸長的毒性及其生物配體模型的構建

郭煊，王學東,*，李菊梅，馬義兵

1. 首都師范大學資源環境與旅游學院，北京 100048 2. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081 3. 澳門科技大學澳門環境研究院，澳門 999078

中國的銻(Sb)儲量大約3.0×106～3.5×106t，超過世界Sb儲量的50%[1]。根據美國地質調查局國家礦產信息中心公布的數據，中國在2018年仍然是全球最大的Sb生產國，占全球Sb產量的70%以上[2]。

近幾年間，由于采礦和冶煉、垃圾焚燒、煤炭和石油燃燒等人類活動日益頻繁，越來越多的Sb元素進入到環境中[3]。Sb礦的開采對周邊環境影響較為明顯，在中國湖南省錫礦山礦區采礦和冶煉過程中產生了大量的固體廢物，礦山北部沿廢物堆和尾礦池的徑流處觀察到最高的Sb濃度達到39.16 mg·L-1[3]，與世界其他受污染地點報告的最高Sb濃度相似[4]。對安徽省3個煤礦采集的33個土壤樣品分析發現超過75%的樣品出現嚴重的Sb污染[5]。

Sb是一種對動植物均存在毒害作用的元素，可造成動物組織病變，植物生長不良、枯萎等毒性影響。林祥龍等[6]對跳蟲進行的Sb毒性試驗表明，設置的濃度范圍內Sb(Ⅴ)不會直接造成其明顯死亡，但會對跳蟲生理行為和繁殖產生一定毒性影響。對小鼠實驗研究發現，Sb2O3可引起肺組織炎性病變，肝臟小片壞死，急性實質性心肌炎病變等毒害作用[7]。植物Sb中毒的癥狀主要表現為生長緩慢、植株矮小、葉片瘦小及根系生長不良，嚴重時還會出現葉片發黃乃至植物枯萎[8-9]。較高的Sb濃度會顯著抑制葉片和根系生物量的產生，并且Sb在植物中的積累會導致植物必需營養素濃度的變化[10]。

土壤環境中過量的Sb會通過食物鏈等途徑進入人體。Sb對人體的急性毒性臨床表現為結膜炎、視神經損傷、嘔吐、腹瀉和血尿等癥狀，慢性毒性主要表現為肺功能改變、慢性支氣管炎等呼吸系統疾病以及心血管系統和腎臟病變，此外，Sb還具有潛在的致癌風險[11]。基于此，了解Sb在土壤環境中的遷移轉化行為對于預防和控制土壤Sb污染具有重要意義。

許多研究表明，在土壤溶液中，Sb主要以Sb(Ⅴ)的形式存在。在廣泛的氧化還原條件(360～140 mV)下，Sb僅以五價形式存在于土壤及土壤孔隙水中[12-13]，即使在厭氧條件下，土壤也可作為促進Sb(Ⅲ)氧化的催化劑[14]，可見土壤中以五價形態存在的Sb幾乎占總Sb量的90%以上[1]。

環境中的pH值和氧化還原條件在很大程度上決定了金屬元素的形態，Wilson等[15]繪制了不同系統下的pe-pH圖，表明了pH值對Sb的形態變化具有重要影響。我國土壤種類復雜多樣，土壤pH差異大，不同pH土壤Sb毒性可能會千差萬別。pH值通過改變金屬離子的化學形態或者與金屬競爭生物配體結合位點進而影響金屬離子的生物有效性和毒性，已有研究表明，pH從4.5到8.5，Cr(Ⅵ)和Ni毒性分別變化了4.73倍和7.28倍，隨pH從4.5升高至8.0，Cu毒性變化了9倍[16-18]。因此，pH值被認為是影響金屬離子在土壤中生物有效性的最重要因素[19]。

最近，生物配體模型(BLM)常被用于水體和土壤環境中量化pH及金屬的一些伴隨離子對金屬毒性的影響[20]。目前，已有關于Cu、Ni、Zn、Cd和Cr等金屬元素毒性預測BLM的報道[16-19, 21-22]，但關于Sb毒性的BLM還鮮見報道。基于此，本研究采用水培試驗的方法，探索pH對Sb毒性的影響及其機制，并利用BLM理論建立其量化關系，從而為土壤中Sb風險評價提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

化學試劑：六羥基銻酸鉀(KSb(OH)6)、CaCl2、NaOH、HCl、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, MES)和3-(N-嗎啡啉)乙磺酸(3-(N-morpholino) propane sulfonic acid, MOPS)，均為分析純，均購于北京百靈威科技有限公司。試驗用塑料燒杯購于北京宏達科萊科技有限公司。大麥品種采用河南省農科院培育的駐大麥六號。

1.2 溶液配制

采取單因素控制的方法，設置9個pH組，分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。在每一個pH值梯度設置7個Sb(Ⅴ)濃度，分別為0、0.0951、0.1902、0.3804、0.7607、1.5215、和3.043 mmol·L-1，溶液pH值采用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl調節，采用1 mmol·L-1MES(pH<7.0)和3.6 mmol·L-1MOPS(pH≥7.0)作緩沖劑，以往研究證明MES和MOPS不與金屬絡合，不影響金屬形態及其毒性[18, 23]。采用0.2 mmol·L-1CaCl2作為背景溶液。所有溶液都使用去離子水配制，每個處理均設置3個重復。溶液pH測定采用pH計(Delta320; Mettler, Zurich, Switzerland)。

1.3 大麥根伸長抑制試驗

大麥根長試驗采用ISO11269-1方法[24]，使用廣口塑料燒杯作為培養容器，選擇健康飽滿的大麥種子，用去離子水沖洗干凈，放置于底層鋪有滅菌濾紙的玻璃培養皿上，并用去離子水沒過種子，在20 ℃、無光照條件下放置36 h，待胚根長至2 mm后移至裝有溶液的培養杯中，每杯6個。培養條件為白天光照14 h，溫度為(24±2) ℃；夜間光照為10 h，溫度為(18±2) ℃。光照強度為25 000 lx。大麥生長約5 d后測定根長，并計算不同Sb濃度處理下的大麥相對根伸長(RE)(%)。

(1)

式中：REt為不同Sb濃度處理下的根伸長；REc為對照根伸長。

1.4 Sb(Ⅴ)形態預測

Sb(Ⅴ)形態通過Visual MINTEQ 3.0計算(http://hem.bredband.net/b108693/)。輸入的參數為pH以及Sb(Ⅴ)、K、Ca和Cl的離子濃度，設置CO2分壓為35.46375 Pa。

1.5 數據統計和處理

劑量-效應曲線用log-logistic方程進行擬合[25]：

(2)

式中：y為相對于對照組的大麥根伸長(%)；x為Sb(Ⅴ)濃度；y0、a和b為擬合常數，a為log10(EC50)。利用擬合曲線求出不同評價指標的EC50值及其相應的95%置信區間。

1.6 生物配體模型的數學基礎

c(TBL)=c(Sb(OH)6BL)+c(OHBL)+c(ClBL)+c(BL)

(3)

式中：c(TBL)為生物配體的絡合容量(mol·L-1)；c(XBL)為與陰離子結合的生物配體活度(mol·L-1)；c(BL)為未被絡合的自由配體活度(mol·L-1)。

(4)

式中：KXBL為條件結合常數，c(Xn-)為陰離子活度。

根據BLM的假設，當競爭離子OH-和Cl-被考慮的時候，整個生物配體結合位點被Sb(Ⅴ)所占據的比例為f，即分配系數，其大小與生物量以及總配體數無關，可以表達為公式(5)。

(5)

當達到50%抑制的時候，公式(5)可以轉化為

(6)

(7)

式中：β為模型參數。將公式(5)中的f帶入到公式(7)中，可得：

(8)

方程最優化檢驗采用最小殘差平方和(RMSE)：

(9)

式中：N、n為處理的數據個數，Robserved大麥相對根伸長實測值(%)，Rpredicted為大麥相對根伸長預測值(%)。

2 結果與討論(Results and disscusion)

2.1 不同pH條件下Sb(Ⅴ)的形態分布

圖1 不同溶液pH下Sb(Ⅴ)的形態分布Fig. 1 The distribution of different Sb(Ⅴ) species as a function of pH

2.2 pH值對Sb(Ⅴ)毒性的影響

表1 不同pH條件下Sb(Ⅴ)對大麥根伸長的半數抑制效應濃度(EC50)值及95%置信區間Table 1 The measured Sb(Ⅴ) toxicity threshold at 50% inhibition (EC50) in the different pH sets for barely root elongation with 95% confidence intervals

圖2 不同pH值下分別以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值變化曲線Fig. 2 The curve of EC50 as a function of pH expressed as (a) and EC50(Sb(OH)5) (b)

圖3 大麥相對根伸長隨和Sb(OH)5 (b)活度變化的劑量效應曲線Fig. 3 Dose-response curve of barley root elongation as a function of (a) and Sb(OH)5 (b) activity

圖4 分別以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值與OH-活度的關系注：圖中實線為線性擬合結果。Fig. 4 The relationship between EC50 value and OH- activity expressed as (a) and Sb(OH)5 (b)Note: The solid line in the figure is the linear fitting result.

(10)

式中：KSb(OH)5BL和KOHBL是形成Sb(OH)5與OH-配合物的穩定常數；將公式(10)代入公式(7)中，可得：

(11)

(12)

由上式可知離子濃度與根伸長RE之間的關系是非線性的，為了明確式中每個變量對RE的影響大小，分別對自變量進行靈敏性分析。控制其他變量不變，調整公式中某一變量，根據RE的變化量及斜率大小，可以判斷每個自變量的靈敏度。靈敏度反映自變量對RE的貢獻，較高的靈敏性表明該成分與大麥根配體位點有更強的親和力。

本文通過溶液模擬試驗探討了不同pH值對大麥根伸長Sb(Ⅴ)毒性的影響，得出的主要結論如下：

圖5 大麥相對根伸長(RE)分別與和Sb(OH)5 (c)的相關關系注：圖中實線為線性擬合結果。Fig. 5 The relationships between barley root elongation (RE) and OH- (a), (b) and Sb(OH)5 (c)Note: The solid line is the linear fitting result.

圖6 考慮和OH-活度后預測的大麥根伸長與實測大麥根伸長的相關關系Fig. 6 Correlation between predicted barley root elongation and measured barley root elongation after considering

(3)依據BLM方程，通過線性和非線性擬合獲得BLM參數，建立了BLM，其預測值與實測數據具有良好的相關關系(r2=0.95，P<0.001)，表明Sb(Ⅴ)的BLM可以很好地預測Sb(Ⅴ)對大麥根伸長毒性。