DA、5-HT 及MAO 在甲基苯丙胺和氯胺酮聯合濫用依賴大鼠CPP 效應中的表達量變化

王一航，洪仕君，鐘磊磊，解潤芳，彭艷霞，李利華

（昆明醫科大學法醫學院，云南昆明 650500）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA），俗稱冰毒，是一種人工合成的中樞神經興奮劑，是當前濫用人數最多的毒品。氯胺酮（ketamine，KET）為苯環己哌啶衍生物，俗稱“K”粉，是非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑，為靜脈麻醉藥，具有一定的致幻效應和精神依賴性，已成為第二大濫用的合成毒品[1]。研究表明，MA 與KET 主要作用于中腦邊緣多巴胺系統（mesolimbic dopamine system，MLDS），導致多巴胺（dopamine，DA）、五羥色胺（5-HT）等神經遞質釋放，使中腦邊緣系統DA 濃度增加從而產生欣快感，使精神活動增強，致藥物成癮[2-4]。目前MA 與KET 聯合濫用趨勢嚴重，已成為當今全球最嚴重的公共衛生問題之一[5-6]。MA 和KET 聯合濫用者出現的興奮癥狀、精神病性癥狀和停藥后的戒斷期癥狀都比單一濫用者要嚴重[7-8]。因此，本研究旨在探討甲基苯丙胺和氯胺酮聯合濫用依賴大鼠DA、5-HT、MAO 的表達變化及其對大鼠條件位置偏愛的影響，對甲基苯丙胺、氯胺酮及兩藥聯合濫用的精神依賴性和成癮機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體重（200±20）g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供。

1.2 藥品及試劑

甲基苯丙胺鹽酸鹽（云南公安刑事科學技術研究所提供甲基苯丙胺片劑，由云南大學化學實驗室提純）；鹽酸氯胺酮注液（云南雙鶴醫藥有限公司，批號130221），所有藥物用生理鹽水溶解后配制成所需濃度，所有藥物配制后放置4℃冰箱保存。

BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；大鼠多巴胺（DA）酶聯免疫吸附測定試劑盒、大鼠單胺氧化酶（MAO）酶聯免疫吸附測定試劑盒、大鼠五羥色胺（5-HT）酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海將來實業股份有限公司，貨號JL12965、JL13513、JL13043）。

1.3 儀器

鼠博士·條件性位置偏愛視頻分析系統（包括計算機、攝像頭、RD1111-CPP-R1 實驗箱體、動物行為學視頻分析系統，版本V2.8.9.5）（上海移數信息科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化公司產品）；手持超聲波細胞破碎儀（上海啟前電子科技有限公司）；高速低冷離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；Synergy HT 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）。

1.4 方法

1.4.1 甲基苯丙胺依賴大鼠模型的建立、分組和給藥給藥前用鼠博士·條件性位置偏愛視頻分析系統對實驗大鼠進行位置偏愛測定，將停留時間短的實驗箱作為伴藥箱。剔除對某一側實驗箱有明顯偏愛的大鼠。

實驗動物分組:取符合實驗條件的36 只大鼠，按隨機原則分為六個組:即（1）正常對照組（Sal組）；（2）甲基苯丙胺(2 mg/kg)組（MA 組）；（3）氯胺酮低劑量(15 mg/kg)組（K15 組）；（4）氯胺酮中劑量(30 mg/kg)組（K30 組）；（5）甲基苯丙胺＋氯胺酮低劑量(2 mg/kg+15 mg/kg)組（MK15組）；（6）甲基苯丙胺+氯胺酮中劑量(2 mg/kg+30 mg/kg)組（MK30 組）（聯用組是藥物混合同時給藥）。

條件性位置偏愛實驗（CPP）模型建立：（2）～（6）組奇數天上午（8:00）腹腔注射（ip）相應劑量藥物，偶數天上午（8:00）ip 等體積生理鹽水；（1）組每天上午（8:00）ip 同體積生理鹽水；共計10 d。第11 天上午（8:00）進行條件位置偏愛檢測。

1.4.2 ELISA 法檢測腦內MAO、DA、5-HT 表達變化完成CPP 測定后，立即將各組大鼠麻醉后快速斷頭處死，根據包新民的大鼠腦立體定位圖譜，冰上迅速分離前額葉皮質、伏隔核及中腦腹側被蓋區，-80℃保存備用。

將所取腦區精確稱重后放入預冷的PBS（含有蛋白酶抑制劑）中在冰上進行勻漿，提取蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，采用ELISA 法分別檢測相關腦區MAO、DA、5-HT 的含量變化。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 行為學結果

2.1.1 與給藥前比較Saline 組大鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間無明顯變化（P＞0.05）；MA 組、K15 組、K30 組、MK15 組、MK30 組大鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間均明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.01），表明MA 組、K15 組、K30 組、MK15 組、MK30 組大鼠經給藥后，形成明顯的條件性位置偏愛，大鼠CPP 模型成功建立，見表1。

2.1.2 與Saline 組比較MA 組、K15 組、K30組、MK15 組、MK30 組大鼠給藥前后的伴藥箱停留時間差均明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.1.3 單用藥組與聯合用藥組比較與MA 組比較，MK15、MK30 聯合用藥組大鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間增加，差異有統計學意義（P＞0.05）。與對應劑量的氯胺酮組比較，聯用組大鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間減少，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

表1 各組大鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間［s，（±s）］Tab.1 Duration of the stay of the rats in each group in the drug-paired compartment before and after the administration［s，（±s）］

表1 各組大鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間［s，（±s）］Tab.1 Duration of the stay of the rats in each group in the drug-paired compartment before and after the administration［s，（±s）］

與給藥前比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖1 CPP 指數Fig.1 CPP Score

2.2 ELISA 檢測結果

2.2.1 大鼠腦內DA 的含量如圖2 所示，與MA組相比，MK15 組前額葉皮質，伏隔核DA 含量呈降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）；MK30組伏隔核及中腦腹側被蓋區DA 含量呈降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.001）。與K15 組相比，MK15 組伏隔核，中腦腹側被蓋區DA 含量都呈升高趨勢，差異有統計學意義（P＜0.001）。與K30組相比，MK30 組伏隔核DA 含量呈升高趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2.2 大鼠腦內5-HT 的含量如圖2 所示，與MA 組相比，MK15 組前額葉皮質，伏隔核5-HT含量呈降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）。與K15 組相比，MK15 組伏隔核5-HT 含量呈升高趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2.3 大鼠腦內MAO 的含量如圖2 所示，與MA 組相比，MK15 組伏隔核及中腦腹側被蓋區MAO 含量呈降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）；MK30 組伏隔核及中腦腹側被蓋區MAO 含量呈降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）。與K15 組相比，MK15 組伏隔核，中腦腹側被蓋區MAO 含量呈升高趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 DA、5-HT、MAO 在前額葉皮質，伏隔核和中腦腹側被蓋區的表達情況Fig.2 Expression of DA，5-HT and MAO in prefrontal cortex，nucleus accumbens and ventral tegmental area

3 討論

CPP 是評價心理依賴的經典模型[9]。本實驗結果顯示，與Saline 組大鼠相比，MA 組、K 組及MK 組大鼠均出現了明顯的CPP 效應（有顯著性差異），這表明無論是單獨給藥還是聯合給藥均可以誘導大鼠產生CPP 效應。此外，在同等KET 劑量下，MK 組伴藥箱停留時間較KET 單用組短；MK組比KET 組產生的CPP 效應低，比MA 組產生的CPP 效應高（無顯著性差異），表明聯合給藥可以誘導大鼠產生CPP 效應，但相對于單獨用藥，這種CPP 效應并沒有顯著提高，甚至發生了降低。有學者通過對斑馬魚的依賴模型研究發現，氯胺酮可以減弱甲基苯丙胺的CPP 效應[10-12]。單胺氧化酶（MAO）對DA、5-HT、去甲腎上腺素等單胺類神經遞質具有高度親和性，是DA 降解過程中的限速酶，在單胺類神經遞質的降解代謝過程中發揮著重要的作用。有研究報道，MA 可抑制MAO 活性，使DA 的代謝受到抑制，導致腦內DA 積聚而產生神經和精神作用[13]。本實驗研究發現，與對照組相比，MA 組的DA 與5-HT 表達均呈一致性增加，而MAO 在不同腦區的酶活性表達存在一定的差異，在前額葉皮質中MAO 表達降低，在伏隔核及中腦腹側被蓋區中MAO 表達增加，表明DA、5-HT 及MAO 表達可能與MA 的CPP 效應有關，同時，提示藥物在不同腦區中作用存在差異性以及MAO 在不同腦區存在一定的表達差異。MAO 分解DA 產生氧活性代謝產物，氧化應激導致DNA、蛋白質等的損傷和功能喪失，為神經毒性的重要機制[14]。本實驗MA 組的MAO 與DA、5-HT 的表達趨勢基本相同，可能此給藥方式沒有造成嚴重的神經毒性。Morgan 等[15]表示小劑量的MA 或KET 多次濫用很少產生神經毒性。提示本實驗可能表現為輕微的神經遞質變化和大鼠的成癮效應，但沒有引起顯著的毒理性改變。通過與MA 組對比發現，聯用組的DA、5-HT 及MAO 表達均呈一致性降低，結合行為學實驗結果表明DA、5-HT 及MAO 的表達水平與聯用組的CPP 效應沒有顯著提升有關，可能是動物行為學改變的神經生物學機制之一。

綜上所述，DA、5-HT 及MAO 在甲基苯丙胺與氯胺酮成癮中發揮著重要作用，甲基苯丙胺與低中劑量氯胺酮單用及聯合都可形成明顯的CPP 效應，但聯合給藥相對于單獨用藥，這種CPP 效應并沒有顯著提高，同時，聯合濫用大鼠腦內DA、5-HT 及MAO 的表達較單獨MA 給藥的水平降低，提示DA、5-HT 及MAO 表達降低與聯用組的CPP效應沒有顯著提高有關，其中的作用機制及甲基苯丙胺與氯胺酮聯合濫用致成癮的機制仍需進一步研究。