星狀神經節阻滯對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響*

鄭建濱，黃娟珍，吳加富，馮小玲，陳鷺

（1.福建醫科大學附屬寧德市醫院 麻醉科，福建 寧德 352100；2.福建醫科大學附屬 第一醫院 麻醉科，福建 福州 350000）

心力衰竭是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的臨床綜合征，屬于心血管疾病的終末階段。隨著中國居民平均壽命增加，心力衰竭發病率也逐年提高，統計資料顯示，我國心力衰竭患病率為0.9%，患者已達1 000萬，居世界首位[1]。幾乎所有的心血管疾病最終都會導致心力衰竭，心肌梗死、心肌病、血流動力學負荷過重及炎癥等原因引起的心肌損傷，均可造成心肌結構和功能的變化，最后導致心室泵血和/或充盈功能低下[2]。細胞凋亡是基因調控下的一種自發性程序化細胞死亡，細胞凋亡可能是心力衰竭發病機制的重要環節之一。心力衰竭患者存在明顯的心肌細胞凋亡過度，伴微血管稀少，小血管平滑肌重塑，血管細胞凋亡現象[3]。如何終止或扭轉心力衰竭細胞凋亡進程已成為改善患者預后的關鍵。星狀神經節阻滯（stellate ganglion block, SGB）是將局部麻醉藥物注射在星狀神經節組織內從而阻滯交感神經，進而維持機體內環境的穩定，糾正植物神經失調[4]。本研究探索SGB對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響，旨在研究SGB對心力衰竭細胞凋亡的影響及其作用機制，為臨床治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠18只，8周齡，體重200～ 250 g，動物許可證號：SCXK（滬）2008-0016，購自上海斯萊克實驗動物技術有限公司，60只大鼠分為SGB組、假手術組和對照組，每組6只。

1.2 試劑與儀器

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和蛋白提取試劑盒均購自南京凱基生物科技有限公司，兔抗大鼠多克隆PI3K、Akt及Caspase-3抗體均購自英國Abcom公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記的山羊抗兔IgG購自美國Sigma公司，兔抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，ELISA檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 心力衰竭大鼠模型復制

參考國外文獻[5]，采用腹主動脈狹窄法復制心力衰竭大鼠模型。腹腔內注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉成功后，取正中切口逐層開腹，打開后腹膜，探及腹主動脈，取右腎動脈上方的腹主動脈一段，鈍性分離后與7號針頭合并結扎，取出針頭，制造0.7 mm直徑的殘腔，逐層縫合關閉切口，繼續飼養。腹主動脈結扎可造成心臟后負荷過重，從而導致慢性心力衰竭，實驗至少需8周才能觀察到心室重構。

1.4 實驗動物分組

心力衰竭大鼠模型復制成功后，SGB組腹腔內注射戊巴比妥50 mg/kg以麻醉大鼠，選擇右側食管旁入路，消毒，切開皮膚組織暴露右側頸動脈鞘，探及頸總動脈、迷走神經和伴行的交感神經，沿食管向下游離，于鎖骨下動脈及椎動脈起始部，可見淡黃色星狀神經節，約1～2 mm大小，呈梭形或星形分布。植入硬膜外穿刺針至星狀神經節分布處，牽引硬膜外導管的另一端自頸前向后引出，逐層關閉切口，固定硬膜外導管至皮膚，處理3 d后經硬膜外導管注入1%利多卡因0.2 ml，2次/d，連續2周；假手術組僅切開皮膚暴露至星狀神經節，然后直接縫合切口；對照組未予以任何處理。

1.5 ELISA檢測心肌組織內TNF-α和IL-1β的表達

連續給藥2周后，處死動物，取出各組心肌組織，組織勻漿，稀釋待測樣品和標準品至合適濃度，按100μl/孔加入到酶標板中，4℃過夜。TNF-α和IL-1β抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100μl/孔，于37℃環境下放置于濕盒45 min。洗板3次。加入親和素過氧化物酶復合物工作液100μl，37℃反應30 min，依次加入TMB顯色液，37℃避光反應30 min，加入50μl終止液，用ELISA檢測儀于450 nm波長處測定吸光度值。

1.6 Western blotting檢測凋亡蛋白PI3K、Akt及Caspase-3的表達

SGB處理2周后，獲取大鼠心肌組織，蛋白提取試劑盒收集細胞蛋白，測定蛋白濃度，取樣品蛋白對靶蛋白PI3K、Akt及Caspase-3表達水平進行檢測。每個樣品蛋白提取物為20μg，120 V恒流電源下利用10% SDS-PAGE分離膠分離樣品蛋白1 h，80 V直流電轉硝酸纖維素膜2 h，2%牛血清蛋白封閉1 h，剪膜，于4℃環境下加入1∶100～1∶500稀釋兔抗大鼠PI3K、Akt、Bcl-2、Bax及Caspase-9多克隆抗體孵育過夜，加入1∶1 000稀釋HRP標記羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30 min，顯色系統中顯色定影，分析雜交條帶。

1.7 心肌組織學觀察

獲取大鼠心肌組織行HE染色。95%乙醇固定20 min，PBS洗滌2次，1 min/次。蘇木精染色2 min，自來水洗滌。鏡下觀察，若細胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數秒，自來水洗滌。浸入伊紅染液染色1 min，自來水洗滌。自然晾干細胞爬片后，中性樹膠封片，放置顯微鏡下觀察。

1.8 TUNEL檢測心肌細胞凋亡

連續給藥2周后，處死大鼠，取出各組心臟組織，4%多聚甲醛固定、包埋，石蠟切片脫蠟，含0.2% Triton X-100的PBS緩沖液破膜10 min，生理鹽水清洗3次，加入50μl TUNEL檢測液，室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，1% DAPI染核60 s，PBS清洗3次。 基因組DNA斷裂時，在脫氧核苷酸轉移酶催化下，將熒光素標記的脫氧三磷酸尿苷標記到3'-OH末端，從而可通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，本研究使用異硫氰酸熒光素對陽性凋亡細胞進行標記，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌組織內炎癥因子水平比較

各組TNF-α、IL-1β水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），SGB組較對照組和假手術組低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組TNF-α、IL-1β水平比較 （n =6，pg/ml，±s）

表1 各組TNF-α、IL-1β水平比較 （n =6，pg/ml，±s）

組別 TNF-α IL-1β SGB組 73.1±9.75 55.8±13.07對照組 189.2±21.38 142.8±36.55假手術組 178.6±19.54 155.4±30.47 F值 40.001 11.250 P值 0.000 0.009

2.2 各組PI3K、Akt及Caspase-3蛋白相對表達量比較

各組PI3K、Akt及Caspase-3蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），SGB組PI3K、Akt蛋白相對表達量較對照組和假手術組高（P＜0.05），Caspase-3蛋白相對表達量較對照組和假手術組低（P＜0.05）。見圖1和表2。

圖1 各組PI3K、Akt及Caspase-3蛋白的表達

表2 各組PI3K、Akt及Caspase-3蛋白相對表達量 比較 （n =6，±s）

表2 各組PI3K、Akt及Caspase-3蛋白相對表達量 比較 （n =6，±s）

組別 PI3K Akt Caspase-3 SGB組 0.398±0.086 0.277±0.079 0.039±0.009對照組 0.065±0.007 0.036±0.005 0.945±0.105假手術組 0.051±0.007 0.026±0.004 0.931±0.112 F值 34.890 28.092 121.042 P值 0.000 0.001 0.000

2.3 各組心肌細胞形態及凋亡細胞比較

各組HE染色結果顯示，SGB組心肌細胞排列規則整齊，而對照組和假手術組心肌細胞空泡化，細胞間隙明顯，部分細胞溶解。見圖2。

在熒光顯微鏡下凋亡細胞呈綠色熒光散在分布，連續給藥2周后，SGB組、對照組和假手術組高倍鏡視野下TUNEL染色平均陽性數分別為（17±2）、（65±5）和（63±4）個，經方差分析，差異有統計學意義（F=147.467，P=0.000），SGB組較對照組和假手術組少（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組心肌組織HE和TUNEL染色病理切片 （×100）

3 討論

人星狀神經節主要由第6、7頸部節與第1胸神經節融合而成，形狀不規則，呈卵圓形，長約2 cm，寬約1 cm。而本研究采用SD大鼠，其星狀神經節相對人類小得多，大小1～2 mm。節后纖維廣泛分布于C3～T12節段的皮膚區域，在功能上屬于交感神經節。SGB涉及植物神經系統、內分泌系統和免疫系統，SBG有助于維持機體內環境的穩定性，改善機體植物神經失調狀態。值得注意的是，心力衰竭患者交感神經興奮性升高，而星狀神經節組織能顯著降低心血管交感神經反射，調節心血管系統植物神經功能，從而降低心臟前后負荷，保護心肌細胞。

心力衰竭屬于心功能不全的失代償階段，炎癥反應和細胞凋亡是心肌細胞功能障礙的病理基礎[6]。有研究表明心力衰竭時，心肌細胞固縮，形成凋亡小體，凋亡指數可達35.5%[7]。本研究通過對SGB治療后心肌組織學觀察和相關凋亡蛋白的分析，探討SGB誘導的心肌細胞保護機制。在眾多炎癥細胞因子中，起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞產生，具有強大促炎作用，能刺激中性粒細胞、T淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的趨化，造成器官功能損傷[8]。IL-1β是一種致炎細胞因子，廣泛參與人體組織破壞、水腫形成等多個病理損傷過程[9-10]。本研究結果證實，與假手術組和對照組相比，SGB組心肌組織內炎癥因子水平顯著降低，表明SGB具有強烈的抑制炎癥反應作用，從而有效保護心肌細胞。

心力衰竭發生、發展過程中出現的一些病理因素，如氧化應激、負荷過重、細胞因子、鈣穩態失衡及線粒體功能失常等，都可誘導心肌細胞凋亡[11]。凋亡包括內源性線粒體細胞色素釋放途徑和外源性死亡受體途徑，Caspase-3是凋亡信號通路傳導的最終凋亡執行分子，而Caspase-8是外源性凋亡途徑的執行者，Caspase-9是內源性凋亡途徑的執行者[12]。鑒于Caspase-3蛋白在凋亡信號通路中守門人的角色，筆者檢測SGB干擾后心力衰竭心肌組織中Caspase-3蛋白的表達，SGB組Caspase-3蛋白相對表達量較對照組和假手術組顯著降低，這表明SGB組細胞凋亡活性被明顯抑制。PI3K/Akt信號通路是目前研究較為透徹的一種經典細胞信號傳導路徑，其功能失調常見于心血管疾病等。PI3K是細胞內重要的信號傳導分子，PI3K可被生長因子、細胞因子和激素等細胞外信號刺激激活[13]。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，催化激活下游信號分子Akt。Akt是細胞存活的主要調節因子，通過直接抑制促凋亡蛋白或抑制轉錄因子產生的促凋亡信號實現調節作用[14]。與假手術組和對照組相比，SGB組可誘導心力衰竭心肌組織中PI3K和Akt蛋白表達升高，表明SGB主要通過影響PI3K/Akt通路，導致下游凋亡信號傳遞受阻，從而發揮抗凋亡作用。因此，筆者推測SGB抗炎癥反應和抗細胞凋亡作用可能是心力衰竭大鼠心肌細胞保護作用的關鍵 因素。