血清microRNA-200c與類風濕關節炎相關間質性肺疾病的相關性分析

朱健偉，李玉娟

（樂山市中醫醫院 1.肺病科，2.腎病科，四川 樂山 614000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）屬于一類進行性系統性自身免疫疾病，發病機制復雜，多累及肺臟[1]。有研究顯示，類風濕關節炎相關間質性肺疾病（rheumatoid arthritis related interstitial lung disease, RA-ILD）是導致RA患者死亡的主要原因之一[2]。因此，加強RA-ILD的早期篩查，及時給予防治措施，是改善患者預后的關鍵。但由于RA-ILD起病隱匿，發病早期缺乏典型的臨床指征，診斷困難[3]。肺活檢創傷性較大，取材受限；肺部高分辨CT（high resolution computer tomography, HRCT）不僅檢查成本高，而且RA-ILD患者發病早期的影像學特征不典型，易發生誤診[4]。MicroRNAs（miRNAs）屬于一類小的非編碼RNA，可參與多種疾病的生理過程[5]。而且循環miRNAs具有高度的穩定性和特異性，分離和檢測操作簡單易行，對疾病的診斷具有其獨特的臨床優勢。既往已有動物[6]和細胞實驗[7]證實，miR-200c在肺纖維化過程中發揮著關鍵作用。本項研究旨在探討RAILD患者血清miR-200c表達水平與肺間質纖維化評分的相關性，探討兩者對RA-ILD患者的早期診斷價值，以及與間質病變程度的相關性，從而為臨床早期診斷和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年8月在樂山市中醫醫院肺病科就診的RA患者87例作為研究對象（RA組）。其中，男性26例，女性61例；年齡21～78歲，平均（58.65±10.44）歲。納入標準：①所有RA患者符合2010年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟制定的類風濕關節炎診斷標準[8]；②年齡≥18歲，男女不限；③臨床資料及治療過程完整。排除標準：①由環境、物理因素、藥物因素、吸煙、塵肺及吸入有機藥物等因素引起的間質性肺疾病（interstitial lung disease, ILD）以及特發性ILD；②伴有明確診斷的其他自身免疫性疾病；③有惡性腫瘤、肺結核、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張及肺部急慢性感染等呼吸系統疾病史。根據臨床癥狀、胸部HRCT及X射線檢查評估結果，將RA組分為RA-ILD組34例及非ILD組53例。RA-ILD組符合2002年美國胸科協會和歐洲呼吸學會達成共識的相應的RA-ILD分類診斷標準[9]，并且為ILD初診患者。其中，男性14例，女性20例；年齡41～78歲，平均（61.36±7.82）歲。非ILD組男性12例，女性41例；年齡21～77歲，平（56.81±10.70）歲。另選取同期30例健康志愿者作為對照組。其中，男性9例，女性21例；年齡33～75歲，平均（59.12±11.34）歲。所有實驗過程均遵從赫爾辛基宣言原則，并通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集分析患者的年齡、性別、體重指數（BMI）、病程、吸煙史、臨床癥狀和體征等。

1.2.2 生物化學指標檢測白細胞（WBC）、血小板（PLT）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、免疫球蛋白及類風濕因子（rheumatoid factor, RF）等生物化學指標。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）采用Trizol法提取血液總RNA；進一步采用mirPremier? microRNA Isolation Kit（美國Sigma公司） 試劑盒分離miRNAs，根據SuperScript RT Kit（日本TaKaRa公司）說明書合成cDNA。以細胞或組織cDNA為模板，以小分子U6作為內參。按照SYBR Green PCR Master Mix（美國Thermo-Fisher公司）說明書進行qRT-PCR。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共計40次循環，60℃繼續延伸5 min。根據NCBI數據庫獲得的資料設計引物，由武漢金凱瑞生物工程有限公司合成。根據使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機陰性對照樣品Ct均值-內參Ct均值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。

1.2.4 肺功能檢查采用FGC-A+型全自動肺功能測試儀（蘇州同科科教設備有限公司）測試患者的肺部功能，包括通氣功能和一氧化氮彌散功能（diffusion rate for carbon monoxide, DLCO）。肺通氣功能損害程度分級為①輕度：1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second, FEV1）≥80%；②中度：FEV1 50%～＜80%；③重度：FEV1＜50%。DLCO損害程度分級為①輕度：DLCO 60%～＜80%；②中度：DLCO 40%～＜60%；③重度：DLCO＜40%。

1.2.5 HRCT采用Asteion 4層螺旋CT（日本東芝公司）進行HRCT掃描，HRCT掃描參數為135 kV，200 mA，軸距掃描，層厚1 mm，層距5 mm，骨窗計算方法，于主動脈弓、隆突、和膈肌上方1 cm 3個基準水平各做1×4層掃描。分別計算3個層面纖維化占相應肺野面積的百分比。根據毛玻璃影、小葉間隔增厚、蜂窩影的累及范圍進行評分，①0分：無異常；②1分：累及范圍1%～25%；③2分：累及范圍＞25%～50%；④3分：累計范圍＞50%～75%；⑤4分：累及范圍＞75%。將評分相加即為間質性肺病評分。所有HRCT均由2位副主任醫師以上職稱放射科醫師共同評分，取平均值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數間距[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗或方差分析或秩和檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關分析用Spearman法，繪制ROC曲線，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA組與對照組血清miR-200c水平比較

RA組與對照組血清miR-200c水平分別為（1.35±0.47）和（1.07±0.38），經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=2.945，P=0.004），RA組高于對照組。RA-ILD組與非ILD組血清miR-200c水平分別為（1.48±0.32）和（1.24±0.30），經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=3.547，P=0.001），RAILD組高于非ILD組。

2.2 RA-ILD組與非ILD組一般資料比較

RA-ILD組與非ILD組年齡、BMI、吸煙史及ILD評分比較，經獨立樣本t檢驗或χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），RA-ILD組高于非ILD組。RA-ILD組與非ILD組病程、腫脹關節數及壓痛關節數比較，經秩和檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），RA-ILD組多于非ILD組。RA-ILD組與非ILD組性別、WBC、PLT、ESR、RF、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）、免疫球蛋白A（Immunoglobulin A, IgA）及免疫球蛋白M（Immunoglobulin M, IgM）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 RA-ILD組與非ILD組一般資料比較

續表1

2.3 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比較

檢查肺功能中的通氣功能，34例RA-ILD組患者中，13例為輕度肺通氣功能障礙，12例為中度肺通氣功能障礙，9例為重度肺通氣功能障礙，不同通氣功能患者血清miR-200c水平比較，經方差分析，差異統計學意義（P＜0.05）；且兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

檢查肺功能中的彌散功能，34例RA-ILD組患者中，15例為輕度肺彌散功能障礙，11例為中度肺彌散功能障礙，8例為重度肺彌散功能障礙，不同彌散功能患者血清miR-200c水平比較，經方差分析，差異統計學意義（P＜0.05）；且兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著肺通氣功能障礙和肺彌散功能障礙程度的加重，患者血清miR-200c水平逐漸升高。見表2。

表2 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比較 （n =34，±s）

表2 不同肺功能RA-ILD患者血清miR-200c水平比較 （n =34，±s）

注：①與輕度者比較，P ＜0.05；②與中度者比較，P ＜0.05。

肺功能 n miR-200c F值 P值通氣功能 輕度 13 1.22±0.27 11.638 0.000 中度 12 1.54±0.26① 重度 9 1.79±0.25①②彌散功能 輕度 15 1.22±0.25 9.971 0.001 中度 11 1.61±0.39① 重度 8 1.78±0.29①②

2.4 RA-ILD患者血清miR-200c水平與ILD評分的相關性分析

經Spearman相關性分析，RA-ILD患者血清miR-200c水平與HRCT檢查的ILD評分呈正相關（rs=0.889，P=0.000）。見圖1。

圖1 RA-ILD組患者血清miR-200c水平與ILD評分的相關性分析

2.5 血清miR-200c診斷RA-ILD的效能分析

繪制ROC曲線分析，血清miR-200c診斷RAILD的AUC為0.787（95% CI：0.687，0.887），敏感性為78.79%（95% CI：0.734，0.792），特異性為62.96%（95% CI：0.601，0.684），約登指數為0.420，截斷值為1.195。見圖2。

圖2 血清miR-200c診斷RA-ILD的ROC曲線

3 討論

RA發病原因復雜，是由多種細胞因子、趨化因子和黏附因子等共同參與的免疫過程，易侵犯全身血管和結締組織，尤其以肺臟為主要受累對象，發病率高達20%以上，可能與肺臟具有豐富的血管和結締組織有關[10]。但是因肺部受累臨床表現及影像學特征并不典型，易與常見的原發性肺部疾病混淆，所以在臨床診療中漏診和誤診率較高。本研究共納入87例RA患者，經胸部HRCT和X射線檢查評估，34例患者發生ILD，但并非所有RA-ILD患者都表現出典型的臨床癥狀。目前胸部HRCT和X射線檢查是我國臨床最常使用診斷ILD的金標準。但是多年來的臨床經驗證實，X射線檢查不僅具有輻射性，而且敏感性相對也較低[11]；HRCT雖然敏感性及特異性均高于X射線，但是檢查費用較貴，在縣級以下的醫療機構中無法實現大規模推廣。因此，從我國現實國情和醫療水平出發，尋找高危患者并進行針對性的監測是最切實可行的方案之一。

本研究中的RA患者以女性為主，且年齡越高，發生ILD的風險越大。有研究證實，＞65歲結締組織疾病患者發生ILD風險較≤65歲患者增加4倍以上。其原因可能是隨著年齡增長，機體免疫功能下降[12]。另外，BMI、病程、吸煙史及受累關節數量等也是影響RA患者發生ILD的危險因素。BMI越高，身體對關節尤其是膝關節和踝關節的壓力越大；而受累關節越多，關節破壞程度越嚴重，則機體內炎癥因子、趨化因子及免疫因子等水平越高，更易造成肺損傷[13]。本研究還發現，RA-ILD組血清miR-200c水平高于非ILD組，并且隨著病情加重，miR-200c表達水平逐漸升高。

有動物研究顯示，肺纖維化模型小鼠的肺泡上皮細胞中miR-200c表達上調，可能與肺纖維化過程中上皮細胞間質化轉化有關[14]。LIU等[15]也進一步證實，miR-200c主要表達于肺泡上皮細胞，是參與肺上皮細胞間質化轉化的關鍵基因，通過調控下游靶基因ZEB1的轉錄和翻譯，促使肺組織發生纖維化。但是目前臨床研究較少探討miR-200c與ILD的關系。本研究發現，RA組血清miR-200c高于對照組，說明miR-200c可能也是參與炎癥反應或免疫反應的關鍵分子。RA-ILD組血清miR-200c水平高于非ILD組，而且與肺通氣功能障礙和彌散功能障礙嚴重程度關系密切。進一步通過ROC曲線分析miR-200c的診斷效能，發現血清miR-200c診斷RA-ILD的效能較高。

綜上所述，高齡、超重、RA病史長、吸煙及受累關節數量多均為RA-ILD發生的危險因素。對有高危因素的RA患者，應密切監測，并建議定期行HRCT或X射線檢查復查，早診斷、早干預以改善預后；另外，血清miR-200c水平有望成為RA-ILD患者的有效診斷指標，且與患者ILD的嚴重程度有關。