水飛薊賓對宮頸癌裸鼠移植瘤抑瘤作用機制研究

賈號

摘 要 目的：探討水飛薊賓對宮頸癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用和作用機制。方法：建立宮頸瘤裸鼠移植瘤模型，分析藥物對裸鼠的抑瘤作用；用間接免疫熒光流式細胞術檢測及Western blotting實驗檢測COX-2、VEGF、Bax和Bcl-2的表達。結果：水飛薊賓可劑量依賴性地抑制宮頸癌裸鼠移植瘤腫瘤組織的生長。間接免疫熒光流式細胞術檢測及Western blotting實驗結果表明水飛薊賓能抑制COX-2、VEGF、Bcl-2的表達、促進Bax的表達。結論：水飛薊賓通過抑制血管生長因子和前列腺素的合成，從而抑制腫瘤細胞的生長；對宮頸癌細胞的殺傷作用是誘導細胞凋亡；降低Bcl-2蛋白的表達、增加Bax蛋白的表達為其誘發宮頸癌細胞凋亡的機制之一。

關鍵詞 水飛薊賓 宮頸癌裸鼠 抑瘤作用

中圖分類號：R285.5； R737.33 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）05-0072-04

Study on the mechanism of silibinin on tumor inhibition of cervical carcinoma transplanted in nude mice

JIA Hao*

（Department of Medicine， the First Peoples Hospital of Shangqiu， Henan Shangqiu 476100， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the antitumor effect and mechanism of silibinin on transplanted tumor of cervical cancer in nude mice. Methods： The xenograft model of cervical tumor in nude mice was established and the antitumor effect of drugs on nude mice was analyzed. The expression levels of COX-2， VEGF， Bax and Bcl-2 were detected by indirect immunofluorescence flow cytometry and Western blotting. Results： It was verified by the determination of indirect immunofluorescence flow cytometry and Western blotting that silibinin could inhibit the growth of tumor tissue in cervical cancer nude mice in a dose-dependent manner and the expression of COX-2， VEGF and Bcl-2 cells and promote the expression of Bax cells. Conclusion： Silibinin can inhibit the growth of tumor cells by inhibiting the synthesis of angiogenic factors and prostaglandins and its killing effect on cervical cancer cells is due to induction of cell apoptosis. One of the mechanisms that induce the apoptosis of cervical cancer cells is due to the decrease of Bcl-2 protein expression and the increase of Bax protein expression.

KEY WORDS silibinin； naked mice of cervical cancer； tumor inhibitory effect

水飛薊賓（silibinin， SB），是從水飛薊素中提取出來的活性成分，目前作為肝保護劑在臨床中廣泛使用，無論是動物實驗還是臨床應用，均顯示良好的保肝作用和極低的不良反應。目前有研究學者發現，SB具有很好的抗腫瘤作用，對各種上皮細胞來源的腫瘤均有良好的作用，如前列腺癌、結腸癌、膀胱癌等[1]。SB已進入前列腺癌的Ⅰ期臨床試驗[1]。不少學者報道了SB抗癌的作用機制，特別是對于宮頸癌和肝癌[2-5]，但是對于動物實驗的研究還很少，本文就SB對宮頸癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用和作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

FACScan流式細胞分析儀（美國Becton Dickinson公司）；F039200酶聯免疫分析儀（奧地利Tecan公司）；Genius 6K-C臺式低速離心機（長沙市鑫奧儀器儀表有限公司）。

1.1.2 細胞和實驗動物

人宮頸癌HeLa細胞購于American Type Culture Collection（ATCC， Manassas， VA， USA）。使用10% 胎牛血清RPMI-1640培養液培養。裸鼠購自商丘美蘭生物工程有限公司，實驗動物許可證號為：SYXK（豫）2017-0006。

1.1.3 試劑

SB（批號0856 9902）、紫杉醇（批號1534 200202）均購自中國藥品生物制品鑒定所）；RPMI-1640培養液（美國Hyclone公司）；抗體均由北京中杉生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

裸鼠，雌性，6～8周齡，質量15～18 g，于商丘美蘭生物工程有限公司SPF級動物房普通飼料喂養。40只裸鼠隨機分為空白對照組、紫杉醇組、低劑量SB組、中劑量SB組、高劑量SB組共5組。然后將0.2 ml細胞懸液皮下接種到裸鼠。待腫瘤長到5 mm以上后，①空白對照組：用飲用滅菌自來水灌胃1 ml，每日1次，連續30 d；②紫杉醇組：用10 mg/kg紫杉醇灌胃1 ml，每日1次，連續30 d。

分別用滅菌自來水配制的0.2、1和5 mg/ml三種質量濃度SB混懸液供低、中、高三劑量組裸鼠灌胃，每日1次，連續30 d。

1.2.2 觀察指標

一般情況觀察：每周1次測量并記錄小鼠及腫瘤組織的基本情況；每天觀察裸鼠的精神狀態及背部瘤組織的生長情況等。

腫瘤組織測量：從給藥第15天起，每 3 d測量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線，V （mm3）= 0.5×L×S2（最大長徑為L和橫徑為S）。停藥次日處死裸鼠，計算抑瘤率（%）=（1-治療組平均腫瘤質量/模型組平均腫瘤質量）×100%。

1.2.3 間接免疫熒光流式細胞術檢測COX-2和VEGF的表達

切取各組組織塊制備細胞懸液，于1 200 r/min離心5 min，將細胞重懸浮于染色液中于室溫30 min。分別加入鼠抗人COX-2、VEGF單抗各20 ml，37 ℃孵育60 min。設立陰性對照組。PBS洗滌后加FITC標記的二抗，混勻，避光室溫孵育30 min，過濾后檢測。

1.2.4 裸鼠移植瘤組織中COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達水平檢測

取凍存組織裂解。BCA測定蛋白濃度，酶聯免疫分析儀測定波長為A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。制備10%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠。吸取40 mg總蛋白，進行電泳分離，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉。β-actin作為內參，1∶800稀釋作為一抗4 ℃孵育過夜。1∶4 000稀釋二抗孵育1 h，然后用顯影液、定影液顯色，掃描圖片保存。

1.3 統計方法

數據用SPSS 25.0處理（t檢驗），數值用均數±標準差表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤接種陽性率

由病理組織學驗證，40只裸鼠注射HeLa細胞株后均長出腫瘤。6～10 d肉眼觀察到長出腫瘤，22～26 d腫瘤生長到直徑≥5 mm。

2.2 藥物對裸鼠的不良反應

各用藥組和對照組相比，裸鼠在飲食量、飲水量、排便、以及活動力上均沒有顯著的差異。

2.3 對腫瘤生長的影響

對照組腫瘤體積增長最快；與對照組相比，各用藥組腫瘤體積的增長有明顯的抑制作用；SB 0.2、1和5 mg/ml連續給藥30 d的荷瘤裸鼠，其抑制腫瘤生長的作用隨著劑量的增加逐漸增大（圖1）。

2.4 對腫瘤抑制率的影響

各用藥組與對照組相比都有不同程度的抑瘤作用，SB的抑瘤作用與紫杉醇相當，且呈劑量依賴性，有統計學意義（P<0.05，表1）。

2.5 對宮頸癌裸鼠移植瘤組織內COX-2、VEGF的表達影響

紫杉醇組、中劑量SB組和高劑量SB組與對照組相比，COX-2和VEGF蛋白表達的熒光測定強度差異有統計學意義（P<0.01，圖2），表明SB可抑制移植瘤中HeLa細胞COX-2和VEGF的表達。

2.6 對宮頸癌裸鼠移植瘤COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達水平的影響

以β-actin為對照，Western blotting檢測各組宮頸癌裸鼠移植瘤組織切片COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達水平，結果顯示，紫杉醇組、中劑量SB組和高劑量SB組與對照組相比，COX-2、VEGF、Bcl-2的表達水平顯著降低（P<0.05，圖3），且其抑制作用與藥物血清濃度呈正相關；而Bax的表達顯著升高（P<0.05，圖3），且其抑制作用與藥物血清濃度呈負相關。

3 討論

裸鼠是一種小鼠突變株，異種移植后的人體腫瘤細胞在裸鼠體內仍保持其原有的組織形態、免疫學特點等性質。本實驗在學校動物實驗中心SPF級實驗室進行，并嚴格按照實驗室規范操作，實驗過程中無裸鼠死亡。

腫瘤細胞依靠分泌血管生長因子（VEGF、bFGF等）保證其自身生長[6]。COX-2是前列腺素合成過程的限速酶，其過表達與腫瘤新生血管形成密切相關[7]。中國傳統藥物的抗腫瘤作用機制主要有誘導腫瘤細胞凋亡[8]、激活免疫系統間接抑制腫瘤等。凋亡主要有線粒體通路，Bcl-2蛋白家族引起線粒體膜通透性增加，引起一系列級聯反應，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族成員，Bcl-2/Bax的比例可決定細胞的命運，其比例增高，細胞不易發生凋亡，而比例降低則會導致細胞凋亡[9]。

本試驗研究發現，SB可劑量依賴性地抑制裸鼠移植瘤腫瘤組織的生長，可下調VEGF、COX-2的表達，表明SB通過抑制血管生長因子和前列腺素的合成，從而發揮抑制腫瘤細胞生長的作用。本試驗還發現SB可上調Bax的表達，下調Bcl-2的表達，Bcl-2/Bax的比例降低，從而激活線粒體信號轉導途徑，促進腫瘤細胞的凋亡。

我們將會對SB抗宮頸癌的活性和作用機制做進一步的研究。SB在體外實驗和動物實驗中均有較好的抗宮頸癌作用，拓展了目前臨床治療惡性腫瘤的思路，不僅對宮頸癌的臨床治療具有指導意義，還可能作為一種防治惡性腫瘤發生發展、抑制其生長轉移的抗腫瘤藥物應用于臨床。

參考文獻

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