SIRT1、Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義＊

龔 磊，呂真冰，喻 晶，任明揚(yáng)，田云鴻，彭 洪

1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院（四川省南充市中心醫(yī)院）胃腸外科（南充637000）；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院（四川省南充市中心醫(yī)院）中西醫(yī)結(jié)合肛腸科（南充637000）

結(jié)腸癌作為一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球常見惡性腫瘤的第三位，目前臨床上治療結(jié)腸癌的首選方法為手術(shù)切除并輔以化療［1］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）是煙酰胺腺嘌呤二核異酸輔酶依賴的去乙酰基轉(zhuǎn)移酶，是重要的抗衰老、抗代謝性疾病的蛋白［2］。SIRT1通過去乙酰化在腫瘤發(fā)展中起到的作用，磷酸化的SIRT1（Phospho－SIRT1）是其去乙酰化的重要調(diào)節(jié)方式［3］。本研究檢測 SIRT1、Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)結(jié)果，分析兩者在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年6月至2016年6月該院行手術(shù)切除的結(jié)腸癌存檔蠟塊和癌旁正常組織（距病變部位＞5cm處，且證實(shí)為無癌浸潤）蠟塊各60例。其中，男性32例，女性28例；年齡37～78歲，平均（58.64±6.09）歲；I期3例，II期19例，Ⅲ期28例，Ⅳ期10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)病理確診為結(jié)腸癌，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度；②無放化療治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)影像學(xué)檢查無法確定TNM［4］分期；②已診斷為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③伴隨其它惡性腫瘤；④合并嚴(yán)重肝腎疾病；⑤患有血液系統(tǒng)疾病或傳染病等。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2 免疫組化方法［5］選取3μm厚度的切片，經(jīng)烤片水化后，修復(fù)抗原，封閉非特異性結(jié)合。試驗(yàn)中使用的一抗分別為：兔抗人 SIRT1、Phospho－SIRT1（pS47）、Ki67和鼠抗人P53單克隆抗體。均滴加DBA進(jìn)行顯色。陰性對照用PBS溶液代替，陽性對照是SIRTl和Phospho－SIRT1陽性標(biāo)本。

3 隨訪情況 采用門診和電話的方式隨訪3年，第1年，每3個月隨訪1次，第2～3年每6個月隨訪1次，末次隨訪時間為2019年6月。隨訪主要通過體格檢查、血常規(guī)、胸片、結(jié)腸鏡檢查確定患者傷口腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的則納入多因素分析，多因素分析采用采用Kaplan－Meier法繪制生存曲線，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SIRT1、Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) SIRT1在癌組織和正常組織中的陽性表達(dá)率分別為66.67%（40／60）和25.00%（11／60），Phospho－SIRT1在癌組織和正常組織中的陽性表達(dá)率分別為46.67% （28／60）和 15.00% （8／60）。SIRT1、Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織（P＜0.05），見表1。

表1 SIRT1、Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)［例（%）］

2 60例患者SIRT1、Phospho－SIRT1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 TNM分期I～I(xiàn)I期的患者SIRT1、Phospho－SIRT1陽性表達(dá)率低于Ⅲ～Ⅳ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。P53陽性患者SIRT1陽性表達(dá)率小于陰性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ki67陽性患者Phospho－SIRT1陽性表達(dá)率大于陰性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SIRT1、Phospho－SIRT1陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 影響結(jié)腸癌患預(yù)后生存的單因素分析 本研究選取60例結(jié)腸癌患者，總生存率為66.67%（40／60），SIRT1陽性組和Phospho－SIRT1陽性組3年生存率分別為55.00%（22／40）、53.57%（15／28）。單因素分析顯示，TNM分期I～I(xiàn)I期的患者3年生存率為86.36%高于Ⅲ～Ⅳ期患者55.26%，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的患者3年生存率44.44%低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者76.18%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SIRT1陽性患者3年生存率為55.00%低于陰性患者90.00%，Phospho－SIRT1陽性患者3年生存率為53.57%低于陰性患者78.13%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同年齡、性別的結(jié)腸癌患者生存率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異（P＞0.05）。見表3。

表2 60例患者SIRT1、Phospho－SIRT1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

表3 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的單因素分析

4 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的多因素分析 以結(jié)腸癌患者術(shù)后3年生存率為應(yīng)變量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素為自變量進(jìn)行賦值（TNM分期I～I(xiàn)I期＝1、Ⅲ～Ⅳ期＝0；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無＝1、有＝0；SIRT1：陰性＝1、陽性＝0；Phospho－SIRT1表達(dá)：陰性＝1、陽性＝0），Logistic回歸分析提示，TNMⅢ～Ⅳ分期、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、SIRT1和Phospho－SIRT1陽性表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表4。

5 結(jié)腸癌患者在不同危險(xiǎn)因素影響下的生存曲線 結(jié)腸癌患者在不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同表達(dá)的SIRT1、Phospho－SIRT1情況下，術(shù)后3年的生存率曲線如圖1～4。

表4 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的多因素分析

圖1 不同TNM分期的結(jié)腸癌患者生存曲線

圖2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者生存曲線

討 論

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率居高不下，由于飲食習(xí)慣的改變，我國確診的結(jié)腸癌患者逐年遞增［7］。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和環(huán)境、遺傳等都有相關(guān)性，多個抑癌基因的失活推測可能與高脂肪高熱量而少膳食纖維的飲食有關(guān)［8］。針對直腸癌的新型抗癌藥物不斷出現(xiàn)，但對患者的生存預(yù)后改變不大，所以，積極開發(fā)可以對直腸癌進(jìn)行早起診斷的靶點(diǎn)是尤為重要的［9］。

SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核異酸輔酶依賴的去乙酰基轉(zhuǎn)移酶，是重要的抗衰老、抗代謝性疾病的蛋白［10］。既往研究指出，乙酰／去乙酰化是人體內(nèi)一種應(yīng)用廣泛的修飾手段，通過對不同底物的作用參與很多種生物學(xué)過程［11］。SIRT1通過去乙酰化在腫瘤發(fā)展中起到的作用，磷酸化的SIRT1（Phospho－SIRT1）是其去乙酰化的重要一環(huán)，對SIRT1的調(diào)節(jié)起一定作用［12］。李合等［13］指出，結(jié)腸癌癌患者SIRT1水平明顯高于健康者。張新元等［14］指出，SIRT1在包括皮膚癌、結(jié)腸癌、卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著雙重作用。于娜等［15］指出，SIRT1可以通過影響標(biāo)記蛋白的轉(zhuǎn)移促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移。本研究中，SIRT1、Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，說明SIRT1和Phospho－SIRT1在腫瘤組織中均呈高表達(dá)。與黃立勇等［16］既往研究一致。

野生型P53是已知體內(nèi)最重要的一種抑癌基因，主要是通過調(diào)劑轉(zhuǎn)錄過程影響細(xì)胞的生長，而突變型P53則是一種促癌基因，在多種惡性腫瘤的組織中可以觀察到突變型P53的存在［17］。利用免疫組化法檢測到的腫瘤組織的P53屬于突變型的促癌基因［18］。Ki67是一種與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)的核抗原，反映了腫瘤增殖的狀態(tài)，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測腫瘤增殖的判斷［19］。賀亞敏等［20］指出，P53可能成為預(yù)測結(jié)腸癌高度轉(zhuǎn)移的新分子標(biāo)志物。石文靜等［21］分析組織內(nèi)Ki67的蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)。本研究分析SIRT1的表達(dá)水平與患者的TNM分期和P53表達(dá)相關(guān)，認(rèn)為SIRT1在結(jié)腸癌中是一個不利的預(yù)后指標(biāo)。Phospho－SIRT1的表達(dá)水平與患者的TNM分期和Ki67相關(guān)，Phospho－SIRT1與細(xì)胞的增殖有關(guān)。本研究結(jié)果與既往研究［22］相符。

本研究選取60例結(jié)腸癌患者，總生存率為66.67%，單因素和多因素分析顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、SIRT1、Phospho－SIRT1是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與董玲玲等［23］研究相似。

綜上所述，SIRT1和Phospho－SIRT1在結(jié)腸癌組織呈高表達(dá)，其中SIRT1的表達(dá)水平與患者的TNM分期和P53表達(dá)相關(guān)，Phospho－SIRT1的表達(dá)水平與患者的TNM分期和Ki67相關(guān)。分析術(shù)后3年結(jié)腸癌患者生存率，提示TNM Ⅲ～Ⅳ分期、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、SIRT1和Phospho－SIRT1陽性表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SIRT1和Phospho－SIRT1與腫瘤形成有相關(guān)性，可能直接影響了結(jié)腸癌患者的預(yù)后生存情況。本研究局限于小樣本和隨訪時間，因此要提高結(jié)果的客觀性還需更進(jìn)一步的開展較大規(guī)模、多中心的研究，并延長術(shù)后隨訪時間；另外本研究選擇的磷酸化抗體只針對SIRT1的某一個磷酸化位點(diǎn)，不能代表SIRT1的全部磷酸化狀態(tài)，有待制做針對多個磷酸化位點(diǎn)的磷酸化抗體。