基于“腎藏精”理論探討不同生長發育期大鼠股骨Klotho mRNA及蛋白表達

任慧敏，陳 偉，羅運鳳，吳雍真，王宗陵，柴藝匯，陳云志*

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.溫州醫科大學附屬第一醫院永嘉分院，浙江 溫州 32510)

腎為先天之本，構成人體生命之本元，腎藏精主骨。中醫認為，人體的生長發育受腎中所藏之精的推動調控及骨髓滋養，關于腎與骨關系的描述最早出現在《黃帝內經》中，《素問·五臟生成論》言：“腎之合，骨也”；《素問·六節藏象論》曰：“腎者主蟄，…精之處也，其充在骨”；《素問·陰陽應象大論》云：“腎生骨髓，在體為骨，腎應骨州”，說明腎與骨密切相關。腎中精氣充沛，則生長發育正常，形體健碩肌肉豐滿，骨骼強壯；腎中精氣虧虛則骨質失養而形體痿弱肌肉瘦削，骨骼無力。目前的研究證實Klotho和腎藏精之間存在著內在關聯。Klotho是1997年Makoto Kuro-o發現的抗衰老基因，在腎臟和腦脈絡膜具有高水平表達，突變后可在所有的器官中表達[1]，并能通過調控維生素D和鈣、磷代謝，保護心血管及內分泌系統等途徑，對衰老等疾病進行調節[2]。研究表明，在Klotho基因缺陷的小鼠模型中表現出多個臟器功能早衰的癥狀，如骨質疏松、聽力下降、血管鈣化、皮膚衰老、性功能減退及高磷酸鹽血癥，甚至出現生長緩慢、壽命縮短等，與中醫學中“腎精虧虛證”的臨床表現非常近似[3]。反之，Klotho基因過表達的轉基因小鼠與野生型小鼠相比平均壽命延長至20%以上[4]。當代醫學闡明腎中所藏之精與支配生命過程的遺傳物質不管是本原，還是推動人體的生長、發育、生育以及調節機體代謝等生理功能方面均擁有高度的一致性。目前，通過調查健康人的血清，發現Klotho 基因表達水平在10歲之前較低，而在青壯年時期Klotho基因表達與年齡呈正相關，并于30～40歲達到高峰，之后Klotho基因隨著年齡的增長而降低[5]。從腎精的興衰過程驗證了腎藏精與Klotho基因的緊密關系，有學者通過研究提出腎藏精的物質基礎可能為Klotho[6]。因此，本研究擬通過研究Klotho mRNA及蛋白表達的改變，初步探討Klotho基因是腎藏精的物質基礎之一。

1 材料

1.1 試劑

蘇木素(珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA-4097)；伊紅溶液(珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA-4099)；Trizol總RNA提取試劑(Aidla公司，批號：252250AX)；HiScript Reverse Transcriptase(VAZYME公司，批號：R101-02)；Ribonuclease Inhibitor(TANS公司，批號：J11202)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R 001)；兔多抗KLOTHO(Abcam公司，批號：Ab181373)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德有限公司，批號：BA1054)；HRP標記兔抗羊二抗(武漢博士德有限公司，批號：BA1060)。

1.2 儀器

2016轉輪式切片機(德國徠卡公司)；MK-3酶標儀(Thermo 公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區中威電子儀器廠)；數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業集團有限公司)；QuantStudio6實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；電泳儀電源(北京六一儀器廠)；蛋白印跡電泳系統(北京六一儀器廠)。

1.3 實驗動物

清潔級大鼠總共32只，其中3月齡SD雌大鼠8只，體重為(209±20)g；9月齡SD雌大鼠8只，體重為(380±20)g；18月齡SD雌大鼠8只，體重為(439±20)g；1月齡SD雌大鼠8只，體重為(125±20)g；均購自于長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

2 方法

2.1 分組

32只健康SD大鼠，分為4組，每組8只，即1月齡組、3月齡組、9月齡組、18月齡組大鼠，稱重、標記。

2.2 取材

摘取大鼠右側后腿股骨、左側后腿股骨，-80 ℃保存；摘取大鼠左側前腿股骨，4%多聚甲醛保存。

2.3 檢測指標

2.3.1 HE染色法觀察大鼠左側前腿股骨生理結構變化將股骨進行組織脫水、包埋，切片脫蠟，用蘇木素染色10～20 min，鹽酸酒精分化5～10 s，放入50 ℃的溫水中返藍，自來水沖洗1～3 min，放入85%的酒精3～5 min，用伊紅染色3～5 min，然后水洗3～5 s，通過梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后在光學顯微鏡下觀察組織形態學變化。

2.3.2 PCR檢測大鼠左側后腿骨Klotho mRNA表達量按照超純RNA試劑盒使用說明，從大鼠左側后腿骨組織制備總RNA，取溶解后的RNA 2 μL用微量分光光度計測定OD260、OD280及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度。根據OD260/OD280比值，估測RNA質量，比值在1.8～2.0之間，根據吸光光度值計算樣品RNA的濃度，在RNA逆轉錄酶及RNA酶抑制劑的作用下(Hiscript Reverse Transcriptase&Ribo-nuclease Inhibitor)以Oligo(dT)為逆轉錄引物，將總RNA逆轉為cDNA，逆轉錄條件分別為25 ℃ 5min、50 ℃ 15min、85 ℃ 5min、4 ℃ 10 min，逆轉完畢后將cDNA靜置于-80 ℃冰箱備用。目的基因作為引物和以GAPDH作為內參基因，引物列為GAPDH，上游引物序列5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，上游引物序列5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT -3′，擴增產物長度253bp；Klotho上游引物序列5′-CATCCGACGAGGACTCTTCTA-3′，下游引物序列5′-GCACATCCCACAGATAGACA -3′，擴增產物長度242bp。PCR實驗需重復3次，每次3 個復孔，根據Real-time PCR原始數據Ct值，并計算相對定量值。

2.3.3 Western blot檢測大鼠右側后腿骨Klotho蛋白表達量提取股骨組織中的總蛋白，分裝并置于-20 ℃保存。依據標準蛋白濃度和相應OD值得出直線回歸方程，代入樣品OD值，計算樣品濃度。制膠、電泳、轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫搖床封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。次日，TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃搖床孵育2 h。ECL發光顯影，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 HE染色法觀察大鼠左側前腿股骨生理結構變化

實驗結果顯示，1月齡組骨干部位密質骨較薄，部分部位密質骨不連續，內側骨髓腔內少量骨小梁形成，骨小梁體積較小；與1月齡組比較，3月齡組骨干部位密質骨增厚，骨組織完整、連續，骨髓腔內骨小梁明顯增多，體積變大；與3月齡組比較，9月齡組骨骺內骨小梁增粗，體積變大，骨髓腔內骨小梁增多，并出現較多且較為明顯的裂紋，少量骨細胞發生壞死；與9月齡組比較，18月齡組的骨髓腔內骨小梁明顯減少；骨干內骨組織和骨髓腔內骨小梁出現大量裂紋，骨細胞發生壞死。見圖1。

注：a：1月齡組；b：3月齡組；C：9月齡組；D：18月齡組

3.2PCR法檢測大鼠左側后腿股骨Klotho mRNA表達量的變化

結果顯示，與18月齡組比較，1月齡組、3月齡組股骨Klotho mRNA表達上升(P<0.05)，和9月齡組的Klotho mRNA表達無明顯差異，見表1。

表1 PCR法檢測大鼠左側后腿股骨Klotho mRNA表達情況 (n=8)

注：與18月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 Western blot檢測大鼠右側后腿股骨Klotho蛋白表達量

結果顯示，與18月齡組比較，1月齡組及3月齡組股骨Klotho蛋白表達顯著升高(P<0.01)，和9月齡組Klotho蛋白表達水平無明顯差異。見圖2，表2。

表2 Wb法檢測大鼠右側后腿股骨Klotho mRNA表達情況 (n=8)

注：與18月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：a：1月齡組；b：3月齡組；C：9月齡組；D：18月齡組

4 討論

中醫學認為“腎藏精主骨”，實質上是腎中精氣促進人體生長發育功能的具體體現。腎藏精，精生髓，骨骼的生長發育依賴腎精的充盈、精髓的濡潤及其所提供的養分，機體骨的生長與老化離不開腎精的滋養。《素問·上古天真論》陳述了女子與男子的生長發育規律：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子；……四七筋骨堅，發長極，身體盛壯；……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。男子八歲，腎氣實，發長齒更；二八，腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子；……四八，筋骨隆盛，肌肉滿壯；……七八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極，八八則齒發去”，說明骨的生、長、壯、衰與腎中精氣的興衰密切相關，而最終導致腎中精氣逐漸虧虛的首要原因是歲數增長[6]。腎精充足則骨質生化有本有源，骨骼受到充養、堅固有力強壯；若腎精虧損則骨質脆弱無力，容易出現骨質疏松、脆性骨折、腰膝酸軟、侏儒、骨痛、骨痹、佝僂等癥狀[7]。

Klotho 是抗衰老基因，對人體生長發育、骨代謝、生殖及脂代謝等有重要影響，其生理功能與中醫“腎藏精”理論，如腎“主骨代謝、主生長發育、主納氣、主水液代謝、主生殖等”有眾多相近之處；在病理表現上，Klotho 基因下調與中醫腎精虧虛、骨失充養也有著相通之處，其表現以成骨細胞數量下降，骨量減少為特征，并且補腎藥物也可上調Klotho 基因的表達。因此，可認為Klotho基因是“腎藏精”的重要成分之一[7]。課題組通過前期研究認為，維生素D與中醫“腎”的功能密切相關，并明確指出維生素D可能是“腎藏精”的重要物質基礎之一[8，9]。此外，維生素D與Klotho關系密切。實驗發現，1，25-(OH)2D3可刺激klotho蛋白的表達[10]，Klotho基因可通過相關途徑調控維生素D體內平衡、骨形成、骨礦化及血磷濃度，從而調節骨的形成[11]。

本實驗研究的HE染色結果顯示，1月齡組骨干部位密質骨較薄，少量骨小梁形成，骨小梁體積較小；3月齡組骨干部位密質骨增厚，骨小梁明顯增多，體積變大；9月齡組骨小梁增多，并出現較多且較為明顯的裂紋，少量骨細胞發生壞死；18月齡組的骨小梁明顯減少；骨干內骨組織及骨髓腔內骨小梁出現大量裂紋，骨細胞發生壞死。PCR實驗結果顯示，與18月齡組比較，1月齡組、3月齡組股骨Klotho基因表達上升(P<0.05)。Western Blot實驗結果顯示，與18月齡組比較，1月齡組及3月齡組股骨Klotho蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與9月齡組Klotho蛋白表達水平無明顯差異。從實驗結果可以看出，Klotho水平表達能反映骨的生長發育的變化情況。綜上所述，腎藏精主骨與Klotho密切相關，其骨的生長和發育的可能和Klotho變化有關，但是尚不清楚其在作用過程中是否涉及其他機制，因此需要更進一步的研究。