獨活寄生湯對膝骨關節炎大鼠SDF-1/CXCR4信號通路的影響

鄭若曦，吳廣文，，陳 俊，邱建清，劉淑如，劉南航

(1.福建中醫藥大學 中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學 中西醫結合學院，福建 福州 350122)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是在力學和生物學因素等多種因素共同作用下，軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨三者降解-合成偶聯失衡的結果[1]。前期研究發現骨關節炎呈現出一種涉及免疫的炎癥環境[2]和營養缺乏的內質網應激[3]，這種環境是一種持久的障礙，觸發了細胞凋亡和新生血管產生。因而，如何克服這種涉及免疫的炎癥環境和應激反應可能是有效治療OA的方法。SDF-1/CXCR4信號通路在免疫調節和炎癥反應等方面具有重要作用[4]。

獨活寄生湯臨床廣泛用于膝骨關節炎(Knee Osteoarthritis，KOA)的治療，療效可靠[5-10]。前期研究[11-17]表明，獨活寄生湯可有效延緩軟骨退變，但是否通過調節SDF-1/CXCR4信號通路發揮作用尚不明確。本研究以SD大鼠KOA動物模型為研究對象，通過觀察獨活寄生湯對SDF-1/CXCR4信號通路相關調節因子的影響，探討獨活寄生湯治療KOA的作用機制，為其臨床應用提供參考依據。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

2月齡SPF級SD大鼠，雄性，45只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.2 主要試劑與儀器

SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-13一抗(美國abcam公司)；MMP-9一抗(美國cell signaling公司)；二抗(美國Millipore公司)；SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13引物(福州尚亞生物技術有限公司)；酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；ABI實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；蛋白核酸分析儀(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 分組與模型復制

45只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為空白組、模型組和治療組3組，15只/組。空白組不做處理；模型組和治療組均在1、4、7天雙膝關節腔注射4%木瓜蛋白酶復制KOA動物模型[18]。術后2周，治療組給予獨活寄生湯臨床等效劑量[19]，按照9.3 g·kg-1·d-1的劑量進行灌胃，空白組和模型組給予等量的0.9%生理鹽水灌胃，共治療8周。

2.2 組織取材與處理

末次灌胃結束后，按照3 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，膝關節備皮，于髕韌帶附著點外上方，用1 mL醫用注射器穿刺入關節腔內，注入滅菌生理鹽水，反復活動膝關節，抽取關節液，置入EP管中，-80 ℃保存，用于SDF-1檢測；隨后打開膝關節腔，收集膝關節滑膜組織，保存在液氮中，用于SDF-1 mRNA和蛋白檢測；取完滑膜組織后，切取脛骨平臺和股骨下端軟骨組織，迅速置入液氮中保存，用于CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白的檢測。

2.3 ELISA法檢測關節液中SDF-1含量

取出-80 ℃保存備用的各組關節液，參照試劑盒說明書測定各組樣本中SDF-1含量。

2.4 Real-time PCR法檢測各組滑膜組織中SDF-1和軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表達

取出液氮中保存備用的各組滑膜組織和軟骨組織，勻漿后，Trizol法提取總RNA；核酸分析儀檢測各樣本RNA濃度和OD260/280值。根據試劑盒說明書，取1 μg總RNA逆轉錄成cDNA。以1 μL cDNA為模板擴增SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13和GAPDH。以GAPDH為內參照基因，計算各目的基因2-ΔΔCt，比較各目的基因mRNA表達水平。

2.5 Western blot法檢測各組滑膜組織中SDF-1和軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達

取出液氮中保存備用的各組滑膜組織和軟骨組織，勻漿后，提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測SDF-1、 CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達情況。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 獨活寄生湯對大鼠關節液中SDF-1含量的影響

模型組大鼠中SDF-1含量較空白組增加，差異具有統計學意義(P<0.01)。采用獨活寄生湯治療后，大鼠關節液中SDF-1含量降低，與模型組相比差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：與空白組相比，a Pb P

3.2 獨活寄生湯對大鼠膝關節滑膜組織SDF-1 mRNA和蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組大鼠膝關節滑膜組織中SDF-1 mRNA表達升高到(2.601 2±0.086 4)，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組大鼠膝關節滑膜組織中SDF-1 mRNA表達降低至(1.907 1±0.046 5)，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖2。獨活寄生湯對SDF-1蛋白的影響與其對SDF-1 mRNA的影響具有類似的趨勢，即與空白組相比，模型組大鼠膝關節滑膜組織中SDF-1蛋白表達升高；經過獨活寄生湯治療后，SDF-1蛋白表達降低。見圖3。

注：與空白組相比，a Pb P

3.3 獨活寄生湯對大鼠關節軟骨組織CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組大鼠軟骨組織中CXCR4 mRNA表達升高至(1.501 1±0.02)，MMP-3 mRNA表達升高至(2.263 8±0.089 5)，MMP-9 mRNA表達升高至(2.081 7±0.077 3)，MMP-13 mRNA表達升高至(2.274 1±0.065)，差異均具有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組大鼠關節軟骨組織中CXCR4 mRNA表達降低至(1.228 1±0.105 3)，MMP-3 mRNA表達降低至(1.656 2±0.058 1)，MMP-9 mRNA表達降低至(1.518 6±0.045 7)，MMP-13 mRNA表達降低至(1.518 1±0.098)，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4。獨活寄生湯對CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達的影響與其對CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA的影響具有類似的趨勢，即與空白組相比，模型組大鼠關節軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達均升高；與模型組相比，治療組大鼠關節軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達均降低。見圖5。

圖3 干預后各組大鼠SDF-1蛋白表達情況

注：與空白組相比，a Pb P

4 討論

骨關節炎(OA)是一種合并滑膜及關節內局部炎癥的疾病。滑膜參與關節軟骨代謝活動，滑膜體積增加可能伴隨軟骨降解[20]。Wei L等[21]研究表明滑膜受到刺激后，炎性滑膜可能分泌一些因子，進而誘導軟骨細胞釋放基質降解酶，從而造成軟骨破壞。然而關節滑膜軟骨的代謝活動受何種信號通路調節，具體作用機制不明。

基質細胞衍生因子 1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)是骨髓基質細胞產生的CXC類趨化蛋白，最初被認為是由骨髓基質細胞、骨髓內皮細胞等產生[22-23]，后來發現KOA患者關節滑膜細胞也會分泌SDF-1到滑液中[24]，若SDF-1與軟骨細胞表面的CXCR4受體結合，就能激活Erk及p38 MAPK等信號通路，從而誘導軟骨細胞釋放MMP-3、9、13等，進而誘導關節軟骨破壞[24-25]。Kanbe等[26]采用ELISA法測定55例KOA患者滑液中的SDF-1濃度，發現患者滑液中SDF-1的含量均高于正常人。Kanbe等[27]發現將SDF-1加入到軟骨細胞內會誘導MMP-9和MMP-13的釋放，而將SDF-1加入到滑膜成纖維細胞則不會改變MMP-9和MMP-13的濃度。總之，SDF-1/CXCR4信號通路在KOA患者的病理進程中具有重要作用。

本研究發現KOA模型大鼠關節液中SDF-1含量明顯高于空白組，經過獨活寄生湯治療后，SDF-1含量降低。進一步采用Real-time PCR和Western blot法，從基因和蛋白兩個方面檢測滑膜組織中SDF-1的表達情況，結果也發現與空白組相比，KOA大鼠SDF-1表達明顯增多，而經過獨活寄生湯治療后SDF-1表達量明顯下降。與此同時，本研究同時采用Real-time PCR和Western blot法檢測大鼠軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達情況，結果發現與空白組相比，KOA大鼠CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表達明顯增多，經過獨活寄生湯治療后大鼠CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表達量明顯下降。由此推測獨活寄生湯可能是通過調節滑膜組織中SDF-1和軟骨組織中CXCR4的表達，進而調節軟骨組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達，起到防治KOA的作用，但是否是唯一途徑，尚需要后期研究進一步驗證。

5 結論

綜上所述，獨活寄生湯可通過調控SDF-1/CXCR4信號通路，進而調節相關因子MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達，從而起到防治KOA的作用。