葛根素對人肺癌A549細胞株遷移與侵襲的作用及分子機制研究

徐正馨，白靜慧

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000)

在全球范圍內(nèi)，肺癌是各種癌癥類型中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。即使有各種醫(yī)治方法不斷涌現(xiàn)，肺癌的總體生存率表現(xiàn)仍不樂觀[1-2]。常規(guī)放化療和靶向治療等會不可避免地導致毒副反應和耐藥性等一系列問題，此時毒副作用小的天然中藥抗腫瘤成分成功吸引了人們的關注。葛根素是一種從中藥材野葛根中提取出來的異黃酮類化合物，具有降壓、降糖、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、抗癌等多種活性[3]。大量實驗發(fā)現(xiàn)葛根素對多種癌癥均有一定治療效果。有研究[4-6]指出葛根素對人肺癌A549細胞的增殖和凋亡有明顯抑制效果，但其對人肺癌A549細胞的遷移及侵襲作用尚未有研究。因此本研究將初步探索葛根素對人肺癌A549細胞遷移和侵襲力的影響，以期為葛根素對肺癌的治療作用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人肺癌A549細胞株由遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實驗室惠贈；胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素及RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；CCK-8試劑購于蘇州宇恒生物科技有限公司；ELISA、Transwell試劑盒購于美國Corning公司；葛根素購于美國Sigma公司，DMSO溶解，制備成100 mmol/L的葛根素原液，無血清培養(yǎng)基稀釋成實驗所需濃度，過濾，-20 ℃儲存。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

采用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)A549細胞，當細胞處于對數(shù)生長期時，胰酶消化，傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。設置陰性對照組，僅為細胞混懸液，不加葛根素處理。葛根素組加入不同濃度(5、10、20 μmol/L)的葛根素溶液，每組設5個復孔。

1.3 CCk-8檢測葛根素對人肺癌A549細胞增殖活力的影響

將5×104個/mL人肺癌A549單細胞混懸液以100 μL/孔的濃度均勻接種于96孔板，24 h后細胞貼壁，加入不同劑量的葛根素溶液(5、10、20 μmol/L)，分別處理24 h、48 h及72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，陰性對照及葛根素組每孔加入100 μL含0.1%血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后的CCK-8溶液，終濃度為10%，37 ℃條件下避光反應1.5 h后，在酶標儀450 nm處測其OD值，采用細胞增殖抑制率公式：(陰性對照組OD值-加藥組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%，計算細胞增殖情況。

1.4 Transwell法檢測葛根素對人肺癌A549細胞遷移能力的影響

常規(guī)培養(yǎng)A549細胞，待細胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)基，加葛根素溶液(5、10、20 μmol/L)，處理24 h，胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基重懸成的(1×105個/mL)單細胞懸液，接種于上層小室，200 μL/孔，小室下層加含胎牛血清的600 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h。甲醛固定15 min，HE染色15 min，采用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況，計算細胞遷移率，遷移率=實驗組/對照組×100%，結(jié)果以細胞遷移率(%)表示。

1.5 Transwell檢測葛根素對人肺癌A549細胞侵襲能力的影響

準備包被好Matrigel基質(zhì)膠的transwell小室，在貼壁細胞中，分別加5、10、20 μmol/L葛根素溶液，干預24 h，胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基制備A549單細胞懸液，3×105個/mL，200μL/孔加入上層小室，下層小室為600 μL含血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦去上室聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面細胞，用PBS清洗2次，甲醛固定15 min，HE染色，倒置顯微鏡觀察侵襲情況，侵襲率=實驗組/對照組×100%(%)。

1.6 ELISA法檢測葛根素對人肺癌A549細胞炎性因子表達水平的影響

收集侵襲實驗中小室上層的細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明，對人肺癌A549細胞炎性細胞因子IL-6、TNF-α與炎癥趨化因子MCP-1、TGF-β的表達情況進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 葛根素對人肺癌A549細胞增殖活力的影響

采用CCK-8法檢測不同濃度葛根素溶液(5、10、20μmol/L)處理A549細胞24、48、72 h后人肺癌A549細胞的增殖活力。結(jié)果顯示葛根素抑制了人肺癌A549細胞的增殖，在時間和劑量上存在交互作用，F(xiàn)=28.620，P<0.05。劑量和時間的F值分別為F=603.605，P<0.05；F=461.129，P<0.05。結(jié)果見表1和圖1。為觀察葛根素對人肺癌A549細胞遷移和侵襲力的影響，選用24 h，濃度為0、5、10、20 μmol/L的葛根素對人肺癌A549細胞進行干預。

組別24h48h72h陰性對照組000葛根素5μmol /L組8.86±1.06①15.78±1.72①26.18±1.79①葛根素10μmol /L組15.10±1.62①②27.68±2.10②③44.06±2.92②③葛根素20μmol /L組23.74±2.2①②③44.36±3.42①②65.06±5.46①②

注：①與對照組比較，②與葛根素5 μmol/L組比較，③與10 μmol/L組比較，P<0.05。

圖1葛根素對人肺癌A549細胞增殖抑制率的影響

2.2 葛根素對人肺癌A549細胞遷移率的影響

細胞遷移是腫瘤進展的重要原因，通過細胞遷移實驗，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度葛根素(5、10、20 μmol/L)干預24 h后，與陰性對照組比較，明顯降低了人肺癌A549細胞的遷移率(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2。

2.3 葛根素對人肺癌A549細胞侵襲力的影響

為了進一步觀察葛根素對人肺癌A549細胞侵襲能力的影響，采用transwell法進行侵襲實驗，結(jié)果顯示葛根素(5、10、20 μmol /L)干預24 h后，與陰性對照組(0 μmol /L)比較，顯著抑制了人肺癌A549細胞侵襲率(P<0.05)，見圖3。

2.4 葛根素對人肺癌A549細胞炎性細胞因子表達的影響

采用ELISA法檢測不同濃度葛根素(5、10、20 μmol/L)干預人肺癌A549細胞24 h后細胞炎性因子的表達情況。結(jié)果表明，與對照組比較，不同濃度葛根素作用的肺癌A549細胞炎性細胞因子IL-6、TNF-α與炎癥趨化因子MCP-1、TGF-β的表達情況均明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

注：與陰性對照組比較，**P圖3葛根素對人肺癌A549細胞侵襲的影響

組別TGF-βMCP-1 TNF-αIL-6陰性對照組85.23±9.1471.26±8.71364.78±18.56231.24±13.72 葛根素5μmol /L組75.46±8.27①60.53±6.57① 315.16±14.21①190.31±10.14①葛根素10μmol /L組58.62±6.37①②47.48±5.19①②253.36±10.34①②109.64±7.35①②葛根素20μmol /L組36.74±3.75①②③23.14±2.85①②③164.17±5.36①②③52.87±3.47①②③

注：①與對照組比較，②與葛根素5 μmol/L組比較，③與10 μmol/L組比較，P<0.05。

3 討論

傳統(tǒng)中草藥中含有多種有效成分[8-9]，其在臨床治療疾病的過程中起著極為重要的作用。黃酮類化合物是多種中藥的有效成分之一，具有多種生物學活性[10]。葛根素即是從干燥野葛根中提取出來的一種天然黃酮類化合物，臨床廣泛應用于心腦血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥及癌癥等多種疾病的治療[11-13]。本研究結(jié)果表明，葛根素可以抑制人肺癌A549細胞的增殖、遷移及侵襲。炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，慢性炎癥可促進癌癥的進展[14-15]。大量研究[16-19]發(fā)現(xiàn)葛根素具有顯著抗炎活性，可通過降低炎性細胞因子、抑制炎癥趨化因子等表達治療多種疾病。炎癥相關因子在腫瘤細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[20]，為此本實驗檢測了葛根素干預后人肺癌A549細胞炎癥相關因子的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素能顯著降低人肺癌A549細胞IL-6、TNF-α、MCP-1、TGF-β的表達水平，表明其對人肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用可能與下調(diào)炎癥相關因子表達有關。

綜上所述，本實驗初步闡明葛根素可以通過其抗炎作用下調(diào)炎癥相關因子表達，進而抑制人肺癌A549細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。為了更深層次地探究葛根素對人肺癌A549細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，今后將從基因-蛋白組學水平探究葛根素對人肺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及炎癥等相關基因、蛋白信號通路的影響，使其應用于肺癌臨床治療的前景更加廣闊。