生殖營養方中多糖提取工藝研究

王秀文，裴曉麗，閆潤紅，盧乃木，寧 娜

(山西中醫藥大學 中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619)

五子衍宗丸補腎益精，主要用于腎虛精虧所致的陽痿不育、遺精早泄、腰痛、尿后余瀝[1]。近年來研究發現，加味五子衍宗方及其有效成分總多糖(TP)能顯著提高輕度認知障礙患者(MCI)的記憶能力，明顯改善由東莨菪堿引起的小鼠記憶獲得障礙[2]。但是作者發現，目前對五子衍宗丸多糖的研究較少，對其提取方法的研究則更少。賀福元等[3]采用超聲提取法對不同批號的五子衍宗顆粒的多糖含量進行了測定，其平均含量僅為12.64%，而本研究報道的生殖營養方是在五子衍宗方的基礎上添加了少量牛磺酸、食用氧化鋅和松花粉等添加劑，并制成膠囊[4]。本實驗采用4種不同的回流提取方法(水提法、醇提法、堿水提取法、堿醇提取法)制備生殖營養方多糖粗品，采用苯酚-硫酸法測定生殖營養方多糖的含量。通過比較多糖的提取率，為尋找較為適宜的生殖營養方多糖的提取工藝提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 實驗藥材及主要試劑

枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、鹽車前子，這五味藥均由北京同仁堂購買，并由山西中醫藥大學裴香萍副教授鑒定為正品；葡萄糖(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；氫氧化鈉(分析純，濟寧市旭力化工有限公司)；氯仿(分析純，北京市亞南偉業氣體有限公司)；正丁醇(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；95%乙醇(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；苯酚(分析純，濟南華凱樹脂有限公司)；濃硫酸(分析純，青島寶澤化工有限公司)。

1.2 實驗儀器

UV-1600紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)；2NHW-Ⅱ型電熱套(鞏義市予體儀器有限公司)；HH-6型水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；GZX-9246MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；LC-4012低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；CR雙表雙關SHB-D循環水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.2 g，加蒸餾水溶解并稀釋至1 000 mL，精密吸取25 mL稀釋至50 mL，配制成濃度為1.140×10-4mg·L-1的對照品溶液，放入冰箱中備用。

2.2 多糖供試液的制備

精密稱取多糖約0.2 g，加入適量蒸餾水溶解，定量轉移至50 mL量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，精密移取0.4 mL此溶液于10 mL量瓶中，加蒸餾水定容，即得。

2.3 生殖營養方多糖的提取方法

2.3.1 水提法 生殖營養方膠囊的制備方法在以前的研究中已有詳述[4]，這里就不再贅述。取7粒生殖營養方膠囊，拆分，取生殖營養方膠囊內容物約2.0 g，精密稱定，加入80倍的自來水，回流1 h。將提取液濃縮至65 mL，并冷卻至室溫，倒入分液漏斗中，用Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)去除蛋白，測得剩余提取液為51 mL，在攪拌的情況下加入3倍量的95%乙醇進行醇沉，醇沉時間為24 h，抽濾，沉淀用無水乙醇洗滌，并在室溫下干燥，稱重，置于干燥器中，備用。

2.3.2 醇提法 取7粒生殖營養方膠囊，拆分，取生殖營養方膠囊內容物約2.0 g，精密稱定，加入80倍量30%的乙醇，回流1 h。從“將提取液濃縮至65 mL”開始，按照“2.4.1”項下方法制得生殖營養方多糖。

2.3.3 堿水提取法 取7粒生殖營養方膠囊，拆分，取生殖營養方膠囊內容物2.0 g，精密稱定，加入80倍量pH=10～11的自來水，回流1 h，從“將提取液濃縮至65 mL”開始，按照“2.3.1”項下方法制得生殖營養方多糖。

2.3.4 堿醇提取法 取7粒生殖營養方膠囊，拆分，取生殖營養方膠囊內容物約2.0 g，精密稱定，加入80倍量pH=10～11的30%乙醇，回流1 h，從“將提取液濃縮至65 mL”開始，按照“2.3.1”項下方法制得生殖營養方多糖。

3 實驗結果

3.1 測定波長的選擇

分別精密量取蒸餾水、濃度為1.140×10-4g·mL-1的葡萄糖對照品溶液和“2.2”項下制備的堿水提取的多糖溶液1.0 mL，分別置于10 mL的量瓶中，并加入5%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，在冷水中放置10 min，用蒸餾水定容至10 mL，放置于冷水中顯色15 min。在波長400～800 nm之間，對這三種溶液進行掃描。結果供試品與標準品溶液在490 nm波長處均有最大吸收，而空白溶液在此波長無干擾，故選用測定波長為490 nm。

3.2 葡萄糖標準曲線的繪制

分別精密移取“2.1”項下配制的1.14×10-4mg·L-1葡萄糖對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL于10 mL量瓶中，分別加入蒸餾水至2 mL，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，置于冷水中放置10 min，加蒸餾水定容，置于冷水中顯色15 min。在490 nm的波長處測定各個試液的吸光度。以葡萄糖對照品溶液濃度(μg·mL-1)為橫坐標，相應的吸光度(A)為縱坐標，進行線性回歸分析，得葡萄糖標準曲線為：y=0.0218x+0.0821(r=0.999 7)，結果表明，葡萄糖在4.56～18.24 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

3.3 方法學考察

3.3.1 精密度試驗 精密吸取1.14×10-4mol·L-1葡萄糖對照品溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，按“3.1”項下顯色方法顯色，測定6次，平均吸光度為0.578 2，吸光度的相對標準偏差RSD為0.56%，表明儀器具有良好的精密度。

3.3.2 穩定性試驗 精密吸取堿水提取、按“2.2”項下方法所配制的多糖供試液1.0 mL，按“3.1”項下顯色方法顯色，分別于0、0.5、1、1.5、2.5、4、6、8 h測定吸光度(A)，考察其穩定性，吸光度的相對標準偏差RSD為0.86%，結果表明，在8 h內，樣品具有良好的穩定性。

3.3.3 重復性試驗 按照“2.3.3”項下方法制備多糖，精密吸取堿水提取、按照“2.2”項下方法所配制的多糖供試液1.0 mL，共6份，分別置于10 mL量瓶中，按“3.1”項下方法測量其吸光度(A)，吸光度的平均值為0.497 8，其RSD為1.9%。結果表明，所用方法具有良好的重復性。

3.3.4 加樣回收率試驗 取生殖營養方膠囊內容物1.0 g，精密稱定，精密加入1.14×10-4g·L-1葡萄糖對照品溶液0.4 mL，按照“2.3.3”項下方法制備多糖6份，精密吸取按照“2.2”項下方法所配制的多糖供試液1.0 mL，共6份，并按“3.1”項下測定方法測定吸光度(A)，平均回收率為99.33%，RSD為1.9%。

3.4 樣品測定

精密吸取按“2.2”項下方法制備的供試液1.0 mL，按照“3.1”項下方法顯色并測定吸光度(A)，計算多糖的提取率，結果如表1所示。從表1可知，4種提取方法中，堿水提取法提取率最高，高達20.83%；而堿醇提取法提取率最低，僅為10.56%。其次，堿水提取法、水提法的提取率均高于醇提法和堿醇提取法的提取率，這可能是由于生殖營養方中水溶性多糖較多的緣故。另外，堿水提取法比傳統的水提法的提取率高約4%，說明堿水提取法改進了生殖營養方多糖的提取方法。

4 結論

堿水提取法的提取率最高，可為生殖營養方多糖提取方法的研究提供參考。苯酚-硫酸比色法測定生殖營養方多糖簡單方便、準確、可靠，且所需儀器簡單、操作方便、顯色穩定。

表1 多糖的提取率 (%，n=3)

5 討論

5.1 料液比對多糖提取率的影響

本研究曾考察了料液比分別為1∶60、1∶80和1∶100對多糖提取的影響。發現當料液比為1∶60時，提取后溶液中沉淀較多，而料液比1∶80和1∶100時沒有沉淀產生，且提取率較高。同時為了節約資源，我們選擇1∶80的料液比。

5.2 乙醇濃度對多糖提取率的影響

本研究曾考察了不同乙醇濃度對多糖提取率的影響，乙醇濃度分別為15%、30%、40%、50%。當乙醇濃度40%和50%時，提取后發現提取液中會析出難溶性沉淀，影響多糖提取率，造成測定多糖含量時有很大誤差。而乙醇濃度15%和30%提取過程中不會析出難溶性沉淀，且乙醇濃度30%的多糖提取率較高，因此選擇乙醇濃度為30%。

5.3 堿水法提取多糖的優勢和原因分析

多糖是極性大分子化合物，溶劑的酸堿性等對多糖提取具有較大影響。目前多采用不同溫度的水和稀堿溶液提取，盡量避免在酸性條件下提取[5]。本實驗采用水提法、醇提法、堿水提取法、堿醇提取法來提取多糖，發現堿水提取多糖的提取率最高，這可能是由于堿溶液對植物細胞起到破壁作用[6]，而且生殖營養方中水溶性多糖較多，使得多糖提取率提高。