正交試驗優選百芩止咳顆粒提取工藝

馮建安，李 希*，張 海，楊 雷，侯豐爵，李雙雙

(1.四川省中醫藥科學院 中醫研究所，四川 成都 610031；2.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 610075)

咳嗽為呼吸系統疾病的常見癥狀。隨著自然環境及氣候變化，咳嗽的發病率呈現不斷上升的趨勢。百芩止咳合劑為四川省中醫藥科學院中醫研究所(四川省第二中醫醫院)臨床使用30余年的經驗方，療效顯著，此方由黃芩、陳皮、百部等藥味組成，具有清熱解毒、化痰止咳的功效，用于風熱咳嗽、痰多，對肺熱咳嗽、急慢性支氣管炎屬熱型療效顯著。方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒[1，2]，善清肺火及上焦之實熱，用于治療肺熱咳嗽，現代藥理學研究表明，黃芩還有解熱鎮痛、抗菌消炎等作用[3-6]，為治療咳嗽的常用中成藥之一[7]。陳皮主要包含橙皮苷為主的黃酮類及揮發油等燥濕化痰成分，用于濕痰咳嗽[8]。陳皮既能燥濕化痰，又能溫化寒痰、理氣健脾、辛散苦泄而能宣肺止咳，為治痰之要藥[9]，現代藥理學研究還發現，橙皮苷具有降低膽固醇、促進胃腸蠕動、抗炎等功能[10，11]，與黃芩共為君藥，發揮清熱解毒、化痰止咳之功效。現根據處方藥味的主要藥效成分的理化性質以君藥黃芩和陳皮中的黃芩苷和橙皮苷轉移率及干膏收率為評價指標，通過正交試驗優選水提取工藝，為本制劑的開發研究提供工藝條件參數。現將研究過程報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器；黃芩苷對照品(批號：110715-201318)；橙皮苷對照品(批號：10721-201617)；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷含量測定

2.1.1 溶液配制 對照品溶液制備：取在60 ℃條件下減壓干燥4 h的黃芩苷對照品8.45 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.338 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液制備：精密量取“正交試驗”項下的濃縮液1 mL，加甲醇至50 mL，超聲處理20 min，冷卻，加甲醇定容至50 mL，濾過，取濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：取缺黃芩的藥材，按正交試驗提取，按“供試品溶液的制備”項下方法同法制成陰性樣品溶液。

2.1.2 色譜條件及專屬性考察色譜柱Agilent Eclipse XDB- C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器；流動相為甲醇-0.4%磷酸(40∶60)；流速：1 mL/min；柱溫25 ℃，進樣量10 μL；紫外檢測波長：280 nm。分別取對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液按照上述色譜條件進行試驗，記錄結果。結果顯示，陰性樣品在黃芩苷峰處無干擾，表明所用方法專屬性良好。見圖1。

注：Ⅰ黃芩苷對照品；Ⅱ樣品；Ⅲ陰性樣品

2.1.3 黃芩苷線性關系考查分別精密吸取黃芩苷對照品溶液2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別得到濃度為67.6 μg/mL、135.2 μg/mL、202.8 μg/mL、270.4 μg/mL、338 μg/mL 的對照品溶液。采用高效液相色譜法進行試驗，分別精密吸取各濃度黃芩苷對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按照“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，測定結果見表1。以峰面積積分值(Y)為縱坐標，黃芩苷對照品的濃度(X)(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2，并計算回歸方程：Y=32.819X+42.556(r=0.999 7)；結果表明：在67.6～338.0 μg/mL范圍內，黃芩苷峰面積積分值與進樣量的線性關系良好。

表1 黃芩苷線性關系考察

注：r=0.999 7。

圖2黃芩苷標準曲線

2.1.4 精密度、穩定性、重復性和加樣回收率試驗精密吸取對照品溶液(0.338 mg/mL)，量取“正交試驗”項下的供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定，計算RSD分別為1.54%、0.40%，表明儀器精密度良好。

精密吸取對照品溶液(0.338 mg/mL)，量取“正交試驗”項下供試品溶液各10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，注入液相色譜儀，測定，RSD值分別為0.80%、0.23%，均小于3%，表明對照品溶液、供試品溶液在24 h內穩定。

精密量取提取液6份，每份1 mL，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，RSD=0.86%(n=6)，表明所用方法重復性良好。

精密量取上述已知提取液9份，每份20 mL，分別按高、中、低濃度精密加入對照品溶液，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，平均回收率=99.6%，RSD=1.01%(n=9)，表明所用方法準確度良好。

2.1.5 樣品含量測定分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定，以外標法計算黃芩苷的含量。黃芩苷轉移率(%)=測得黃芩苷含量(mg/g)/藥材中黃芩苷含量(mg/g)×100%。

2.2 橙皮苷的含量測定

2.2.1 溶液配置對照品溶液的制備：取橙皮苷對照品12.70 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.508 mg/mL的橙皮苷對照品溶液。

供試品溶液制備：精密量取“正交試驗”項下的濃縮液10 mL，濃縮至干，加甲醇至50 mL，超聲處理20 min，冷卻，加甲醇定容至50 mL，濾過，取濾液，即得。

陰性樣品溶液制備：取缺陳皮的處方藥材，按正交試驗提取，按“供試品溶液的制備”項下方法同法制成陰性樣品溶液。

2.2.2 色譜條件及專屬性考察 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-6%冰醋酸(24∶76)；流速：1 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫30 ℃；紫外檢測波長：283 nm。分別量取陰性樣品溶液、樣品溶液、對照品溶液按照上述色譜條件進行試驗，記錄結果。結果顯示，陰性樣品在橙皮苷峰處無干擾，表明所用方法專屬性良好。見圖3。

2.2.3 橙皮苷線性關系考察 分別精密吸取橙皮苷對照品溶液2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別得到濃度為67.6 μg/mL、135.2 μg/mL、202.8 μg/mL、270.4 μg/mL、508 μg/mL的對照品溶液。按照高效液相色譜法試驗，分別精密吸取橙皮苷對照品溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜儀，按照“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，測定結果見表2。以峰面積積分值(Y)為縱坐標，橙皮苷對照品的含量(X)(μg)為橫坐標，繪制標準曲線(圖4)，并計算回歸方程：y=3733.6x+307.03(r=0.999 7)；結果表明在0.1016～0.508 mg/mL范圍內，橙皮苷峰面積積分值與進樣量的線性關系良好。

表2 橙皮苷線性關系的考察

注：r=0.9997。

2.2.4 精密度、穩定性、重復性和加樣回收率試驗 精密吸取對照品溶液(0.508 mg/mL)，量取“正交試驗”項下的供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定，計算RSD值分別為0.80%、0.93；RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

精密吸取對照品溶液(0.508 mg/mL)，量取“正交試驗”項下的供試品溶液各10μL，分別于0、2、4、8、12、24 h，注入液相色譜儀，測定，RSD值分別為0.79%、0.59，均小于3%，表明對照品溶液、供試品溶液在24 h內穩定。

精密移取提取液6份，每份10 mL，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，RSD=0.93%(n=6)，表明所用方法重復性良好。

精密移取上述已知提取液9份，每份20 mL，分別按高、中、低濃度精密加入對照品溶液，按照“供試品溶液的制備”方法進行處理，并按照上述色譜條件測定，平均回收率=100.6%，RSD=1.31%(n=9)，表明所用方法準確度良好。

2.2.5 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測定，以外標法計算橙皮苷的含量。橙皮苷轉移率(%)=測得橙皮苷含量(mg/g)/藥材中橙皮苷含量(mg/g)×100%。

注：Ⅰ對照品；Ⅱ樣品；Ⅲ陰性樣品

圖4橙皮苷標準曲線

2.3 干膏收率

用移液管精密吸取提取濃縮液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥至恒重，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算干膏收率。干膏收率=測得干膏重(g)/正交試驗用藥材的量(g)×100%。

2.4 正交試驗

采用水煎煮提取的方法，影響水提效果的因素主要有藥材粉碎粒度、提取溫度、加水量、煎煮時間、煎煮次數等。根據湯劑的制備方法、藥材所含成分的性質和制劑生產的實際情況，藥材采用飲片形式以水煎煮提取數次，即可充分浸出有效成分。因此，對加水量、煎煮時間和次數3個因素各設3個水平，按照L9(34)正交表安排試驗，因素水平，見表3。

按處方比例稱取藥材75g，按表中正交試驗條件進行提取，過濾，濾液濃縮至200 mL，備用。按照“2.1.5”和“2.2.5”項下方法分別測定黃芩苷、橙皮苷轉移率，按照“2.3”項下方法測定出膏率，并將3項綜合加權評分為指標，權重系數分別定為0.4、0.4、0.2，考察各因素對提取工藝的影響。結果見表4、表5。

表3 試驗因素水平

表4 正交試驗結果

注：W=X*40+Y*40+Z*20。

表5 方差分析

由表4直觀分析結果可知，影響提取效果的因素順序為：C>B>A，即煎煮次數>煎煮時間>加水倍數，最佳提取工藝條件為A3B3C3；由表5方差分析結果可知，B3與B2相差不大，將B3調整為B2，并結合生產實際，從節約能耗出發，將C3與 C2對比驗證，即進行3次A3B3C3、A3B2C2的對比驗證試驗。

2.5 對比驗證試驗

按A3B3C3、A3B2C2工藝條件，分別進行3組平行試驗，結果見表6。

表6 對比驗證試驗結果

由表6可知，工藝條件A3B3C3與工藝條件A3B2C2所得結果黃芩苷轉移率、橙皮苷轉移率、干膏收率、綜合評分均相差不大，且工藝穩定。因此，為節約能耗，選擇水煎煮工藝為加8倍水，煎煮2次，每次1.0 h。

3 討論

百芩止咳顆粒主要功效為清熱解毒、化痰止咳，用于風熱咳嗽、痰多。本研究工藝采用水提取，保證了與原湯劑物質基礎和療效的一致性。查閱組成本方的藥物，其所含的有效成分主要為黃酮類、生物堿類等成分，能印證提取工藝的合理性。采用本實驗優選后的提取工藝，其主要有效成分黃芩苷和橙皮苷的轉移率均較高，為本方改良為顆粒劑和提升質量標準提供了依據。

本實驗主要選用黃芩苷及橙皮苷的含量為主要評價指標，對提取工藝進行正交設計，優化其制備工藝，確定百芩止咳顆粒的最佳提取工藝。但由于中藥復方的復雜性，只對君藥的黃芩和陳皮的有效成分進行了含量測定，而未對其他成分進行含量測定，所以評價指標還不夠全面。如果在工藝提取優選過程中，同時對提取液主要藥效進行對比驗證，將使優選更加準確。