苦木藥材中總生物堿的含量測定及聚類分析和判別分析

劉明穎，廖小菁，徐 瀅，劉地發，呂武清，鄧雙炳*

(1.江西青峰藥業有限公司，江西 贛州 341000；2.創新天然藥物與中藥注射劑國家重點實驗室，江西 贛州 341000)

苦木為苦木科苦木屬植物Picrasmaquassioides(D.Don)Benn，又名苦樹，以其干燥枝和葉入藥。本品苦寒，有小毒，歸肺、大腸經，具有清熱解毒、祛濕的功效，主要用于風熱感冒、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、濕疹、瘡癤、蛇蟲咬傷等病癥的治療[1]。日本學者Kondo和Takemoto[2]首次從苦木藥材中分離得到兩個β-咔巴啉型生物堿，之后中外學者發現苦木藥材中的主要化學成分為生物堿，苦味素次之。其中生物堿類成分有61個，包括β-咔巴啉型生物堿38個，鐵屎米酮型生物堿12個，生物堿二聚體11個，苦味素類成分44個[3-4]。現代藥理學研究表明，苦木藥材中的主要活性成分為生物堿，具有抗菌[5]、抗炎[6]、抗瘧[7]、抗腫瘤[8]、降壓[9]、抑制cAMP磷酸酯酶活性[10]、抑制骨質疏松[11]等作用。2015年版《中國藥典》中苦木質量標準尚未收載含量測定項，而2014年版江西省中藥材標準[12]則是通過氯仿多次萃取后稱重進行測定，此法步驟繁多，平行性差，操作誤差大，檢測限高，且氯仿屬于二類溶劑，毒性較大。苦木藥材質量研究報道多為HPLC法測定其單個或若干個生物堿的含量[13-14]，其總生物堿含量測定的研究鮮有報道。本文以苦木含量較高且為主要活性成分的苦木酮為對照品，建立紫外分光光度法測定不同產地不同部位30批次苦木藥材中總生物堿的含量，通過聚類分析和偏最小二乘法判別分析的方法對苦木藥材質量進行評價，以期為苦木及其制劑質量標準的提高提供參考和借鑒。

1 材料

紫外-可見分光光度計UV-2550(島津)；電子分析天平XS105DU、ML204T(梅特勒-托利多科技有限公司)；超聲清洗器KQ-300DE(昆山市超聲儀器有限公司)；數顯恒溫水浴鍋HHS-11-2(上海博迅實業有限公司)；無水乙醇、鹽酸均為分析純(廣東光華科技股份有限公司)；水為超純水(Mili-Q自制)。

苦木酮(5-Hydroxy-4-methoxycanthin-6-one)為自制，經光譜學鑒定結構，質量平衡法檢測其含量為98.8%。苦木測試樣品共30批，經中國科學院昆明植物研究所龔洵研究員鑒定為苦木科苦樹屬植物苦木Picrasmaquassioides的莖和粗枝，于江西青峰藥業有限公司留存。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

取苦木酮對照品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇制成每1 mL中含苦木酮0.1 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取本品粉末(過四號篩)約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放置至室溫，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。過濾后濾渣再精密加入80%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放置至室溫，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。分別精密移取上述過濾液25 mL，合并置于蒸發皿中，水浴蒸干，用10 mL 2%鹽酸溶液分3次溶解提取物，并轉移至25 mL量瓶中，超聲10 min使之溶解，加2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密移取上述濾液的續濾液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加入2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 吸收波長選擇

取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液分別在190～400 nm范圍內進行掃描，記錄光譜圖，結果表明對照品溶液和供試品溶液在318 nm處均有最大吸收。

2.4 標準曲線制備

精密量取對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加入2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，以2%鹽酸溶液為空白，采用紫外-可見分光光度法，在318 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線。

2.5 測定法

依法測定，通過標準曲線計算，即得。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察 取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液，分別在190 ～400 nm波長范圍內進行掃描，記錄光譜圖。結果顯示空白溶劑無干擾，表明方法專屬性良好。

2.6.2 線性范圍考察 按照“2.4”項下制備標準曲線供試品，于318 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=0.045 968 0x+0.006 073 00，相關系數r=0.999 9。表明苦木酮在0.004～0.02 mg/mL濃度范圍內與吸光度線性關系良好。

2.6.3 精密度試驗 (1)儀器精密度試驗。取同一對照品溶液，按照“2.5”項下方法重復測定6次，得到苦木酮吸光度RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

(2)重復性試驗。取同一批號樣品共6份，按照“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測定總生物堿的含量，計算得到總生物堿的含量RSD值為1.3%，說明該方法重復性良好。

(3)中間精密度試驗。由不同分析人員在不同日期，按照“2.1”項下對照品溶液的制備方法制備對照品溶液。取同一批號樣品6份，按照“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測定總生物堿的含量，計算得到總生物堿的含量與上述重復性的結果進行計算，得到RSD(n=12)值為2.9%，說明該方法中間精密度良好。綜上所述，本方法的精密度良好。

2.6.4 穩定性試驗 取供試品溶液，室溫保存，按照“2.5”項下測定法測定，分別于放置0 h、1 h、2 h、4 h、5 h、24 h時測定其的吸光度，測得供試品溶液吸光度的RSD為0.2%，結果表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。對照品溶液在冰箱放置7天內，吸光度RSD為0.5%，含量RSD為0.9%，表明對照品溶液在7天內較為穩定。

2.6.5 加樣回收率試驗 取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入苦木酮對照品儲備液適量，按照“2.2”“2.4”和“2.5”項下方法測定含量，計算加樣回收率(n=9)。結果表明苦木酮的平均回收率為100.22%，各濃度項下的平均回收率均在90%～108%范圍內，且回收率的RSD為2.8%(≤5.0%)，表明本方法的準確度良好。結果見表1。

2.6.6 耐用性考察(1)不同波長。取供試品溶液，分別于316 nm、318 nm、320 nm處進行測定，根據各波長下的標準曲線，計算得到不同波長處總生物堿的含量。不同波長下測得的含量RSD為0.7%，本法在檢測波長±2 nm下耐用性良好。

(2)不同酸濃度。在“2.3”項下分別用1.8%、2.0%、2.2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。對照品溶液的制備同重復性試驗，依法進行測定。不同酸濃度下，苦木藥材莖總生物堿含量的RSD為2.6%(<3.0%)，表明本法在酸濃度±0.2%下耐用性良好。

2.7 樣品測定

取不同批號苦木藥材莖樣品，按照“2.5”項下方法測定吸光度，通過標準曲線計算供試品溶液中總生物堿的含量，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果

表2 樣品含量測定結果

2.8 聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對總生物堿含量進行聚類分析，聚類方法為組間聯接，度量標準區間為平方Euclidean距離，進行系統聚類分析，見圖1。通過分析可將上述30批次藥材分為兩類，湖北荊門莖和廣東英德莖可以歸為一類，廣西河池莖、貴州都勻莖、湖北荊門粗枝和廣西河池粗枝可以歸為一類。由表2和圖1中可以看出，不同產地和不同部位苦木藥材總生物堿含量差異較為明顯。

圖1不同產地不同部位苦木藥材的聚類分析

2.9 偏最小二乘法-判別分析

采用SIMAC-P 11.5軟件對總生物堿含量進行判別分析，以批號、產地、部位為自變量，總生物堿含量為應變量，得到貢獻率圖和得分散點圖，如圖2、圖3所示。通過貢獻率圖，可以得出苦木藥材的用藥部位對總生物堿的影響最大，其次是產地；但是因部分產地苦木藥材的總生物堿含量水平較低，其貢獻率不突出。

圖2PLS-DA法分析貢獻率

分散點圖可以很好地將粗枝和莖進行分別，但是由于不同產地苦木藥材莖的總生物堿含量差異較為顯著，產地方面無法很好地進行分類。

圖3PLS-DA法得分散點圖

3 討論

本文建立了苦木藥材中總生物堿的含量測定方法，結果表明本方法操作簡便，精密度、重復性、穩定性、回收率均較好。本研究發現不同產地苦木中總生物堿含量差異較大，其中湖北荊門苦木的總生物堿含量最高(0.75%)，廣西河池次之(0.40%)，而廣東英德最低(0.32%)，可能由于生長環境、氣候、植物生長年限的不同導致其含量存在差異；且苦木不同藥用部位總生物堿含量差異也較大，莖的總生物堿含量明顯高于粗枝，可能由不同藥用部位組成不同引起含量差異。苦木作為具有重要藥用價值的天然藥物資源，研究其主要活性成分總生物堿的含量，可為苦木及其制劑質量標準的提高提供參考，為苦木藥材的合理開發和利用奠定基礎。