一測多評法測定葛酮通絡膠囊中5種成分的含量

牛海軍，孫旭群，李曉亮，李光輝，路大勇，楊小梅，李玉梅

(1.安徽九方藥物研究院有限公司 研發部，安徽 合肥 230088；2.安徽醫科大學第一附屬醫院 藥劑科，安徽 合肥 230022；3.安徽九方制藥有限公司 研發部，安徽 亳州 236800)

葛根通絡膠囊是從豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根中提取純化并制劑成型，為葛根總黃酮單體植物藥，其有效成分總黃酮含量達到80%以上，遠高于國內外其他植物黃酮類制劑，其具有活血化瘀之功效，用于缺血性中風中經絡恢復期瘀血痹阻脈絡證，癥見半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、語言不利、頭暈目眩、頸項強痛等，動脈粥樣硬化性血栓性腦梗塞和腔隙性腦梗塞見上述證候者[1-2]。本公司多年來致力提高本產品質量控制，采用高效液相色譜法等不同分析手段，對本品黃酮類成分進行測定作為質量控制手段，并建立了其指紋圖譜的測定方法[3-7]。以往常利用單品對照外標法測定各個有效成分含量，用到的對照品較多以致成本較高、工序復雜，限制了此法在企業實際生產中的應用。一測多評法(QAMS)[8-18]可在對照品較少的情況下對中藥及其制劑進行快速、低成本質量控制，所以本研究采用一測多評法測定葛酮通絡膠囊中5種成分含量，進一步提升質量標準。

1 儀器與試劑

島津LC-10AT液相色譜儀，包括LC-10AT色譜泵、SPD-M10Avp DAD檢測器、SIL-10A自動進樣器、Lcsolution色譜工作站。甲醇和乙腈均為色譜純，美國天地公司；其他試劑均為分析純。3＇-羥基葛根素對照品：成都普瑞法科技開發有限公司，批號：15052309；葛根素對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號：752-200108；3＇-甲氧基葛根素對照品：上海源葉生物科技有限公司，批號：P25D6F8070；葛根素芹菜糖苷對照品：上海源葉生物科技有限公司，批號：P09J7F8770；大豆苷對照品：成都普瑞法科技開發有限公司，批號：15031507。葛酮通絡膠囊：安徽九方制藥有限公司，批號：180401、180402、180602、180702、180801、180802、180901、180902、181101、181201。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相為甲醇-乙腈(70∶30)和0.05%磷酸溶液二元梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長250 nm，色譜柱為ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，所有組分在50 min內洗脫完全。見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱取3＇-羥基葛根素對照品、葛根素對照品、3＇-甲氧基葛根素對照品、葛根素芹菜糖苷對照品和大豆苷對照品適量，用甲醇稀釋成1 mL含葛根素100μg、3＇-羥基葛根素對照品10 μg、3＇-甲氧基葛根素對照品10 μg、葛根素芹菜糖苷對照品10 μg和大豆苷對照品10 μg的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取葛酮通絡膠囊內容物，混勻，研細，取約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加70%甲醇適量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關系考察

分別精密量取對照品濃配液，用甲醇稀釋成一系列對照品溶液。按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄5種成分的峰面積。以待測成分進樣濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，分別得到5種成分的回歸方程和線性范圍。見表2。

表2 5種成分的回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗

以葛酮通絡膠囊(批號：180401)為供試品，按“2.3”項下方法制備1份供試品溶液，連續進樣6次，分別記錄5個成分的峰面積。結果峰面積的RSD值分別為0.21%、0.33%、0.25%、0.11%、0.28%(n=6)，試驗結果表明本方法精密度較好。

圖1混合對照品色譜

峰1：3＇-羥基葛根素峰；峰2：葛根素峰；峰3：3＇-甲氧基葛根素峰；峰4：葛根素芹菜糖苷；峰5：大豆苷峰

2.6 穩定性試驗

以葛酮通絡膠囊(批號：180401)為供試品，按“2.3”項下方法制備1份供試品溶液，分別在室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，測定其峰面積，5種成分24 h內峰面積的RSD值分別為0.18%、0.32%、0.79%、0.81%、0.37%(n=6)，試驗結果表明本法制備的樣品溶液在24 h內穩定性較好。

2.7 重現性試驗

以葛酮通絡膠囊(批號：180401)為供試品，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，以“2.1”項下的色譜條件進行測定，5種成分峰面積的RSD值分別為0.57%、0.92%、0.76%、1.02%、0.56%(n=6)，試驗結果表明本法重現性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批樣品適量，分別加入一定量的5種成分對照品，按照“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，以“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算加樣回收率及RSD值。結果5種成分的回收率依次為98.1%、99.8%、97.7%、100.3%、98.5%，RSD值分別為1.23%、0.81%、1.55%、1.07%、0.93%，試驗結果表明本法準確度較好。

2.9 相對校正因子(RCF)計算

本研究以葛根素為內標物，按照一測多評法公式計算，結合混合對照品溶液測得的峰面積，計算葛根素對另外4種成分的RCF值。結果3＇-羥基葛根素、3＇-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷的RCF值分別為0.993、1.054、0.965、1.025。

2.10RCF耐用性考察

本研究中考察了不同儀器設備和不同的色譜柱(250 L×4.6 mm，5 μm)對RCF測得結果的影響，結果見表3，表明本次考察的儀器和色譜柱耐用性較好。

表3 不同儀器和色譜柱測得的RCF

2.11樣品的含量測定

分別取葛酮通絡膠囊10批次樣品適量，按照“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，以“2.1”項下的色譜條件進行測定，對比一測多評法(QAMS)與外標法曲線法(ESM)測得的5種成分的含量，結果見表4。結果表明2種方法測定的3＇-羥基葛根素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷的含量無明顯差異。

表4 不同儀器和色譜柱測得的RCF (mg/粒)

3 討論

葛酮通絡膠囊是由葛根總黃酮與適量輔料經加工制成的膠囊。葛根總黃酮從植物葛根中經提取分離、純化得到的黃酮類成分，是目前唯一的葛根總黃酮單體植物藥，其有效成分總黃酮含量達到72%以上。目前該標準為新藥轉正標準第79冊，其含量測定中僅以葛根素單一成分作為質量控制指標，存在一定的局限性，本研究的建立能更好地控制產品的質量。

研究中采用DAD檢測器對供試品溶液在200～400 nm進行掃描生成三維色譜圖，對不同波長下的色譜圖進行分析，結果在主成分葛根素的最大吸收波長250 nm下，能夠檢出其余4種成分峰，且各峰響應值較大，因此選定 250 nm為測定波長。

本研究以葛根素為內標物，使用外標曲線法與一測多評法測定4種成分的含量無明顯差異，本法操作簡便，穩定性較好，檢測成本較低。由于葛根素對照品價廉易得，性質穩定，所以選擇葛根素為內標物。

本研究中建立的一測多評法穩定性、重復性、精密度均較好，且采用了多批次樣品的驗證，可用于評價葛根通絡膠囊質量的真實性、優良性和穩定性。