黃芩苷預防和治療牙周炎研究進展

李伶俐，李 瀟

(1.暨南大學 口腔醫學院，廣東 廣州 510632；2.中國人民解放軍南部戰區總醫院，廣東 廣州 510010)

牙周炎是牙菌斑與宿主免疫反應相互作用后產生的炎癥性疾病，炎癥破壞牙周支持組織形成牙周袋，最終導致牙齒松動脫落。目前，對于牙周炎的經典治療方法是機械性清除菌斑、牙石并控制其他局部刺激因素。但在復雜的牙根結構中存在器械無法達到的盲區，這些區域的細菌無法通過器械徹底去除。此外，口腔內其他部位的微生物可再定植于牙周袋內。因此，臨床上通常會使用抗菌藥物作為機械性治療的補充。常規抗菌藥物有硝基咪唑類、四環素類、羥氨芐青霉素類等。但長期使用抗菌藥物不僅會使細菌耐藥性增強，還會導致患者口腔和腸道菌群紊亂，甚至出現牙齒染色、嘔吐和腹瀉等副作用。黃芩是許多中藥制劑的常見成分，它可用于炎癥、高血壓、心血管疾病以及細菌和病毒感染的治療。黃芩的主要活性成分是黃芩苷(baicalin，BC)，它是從黃芩根中分離得到的黃酮類天然化合物。研究發現黃芩苷具有多種不同的藥理活性，如抗菌、抗炎和抗氧化等[1]，使其有望成為預防和治療牙周炎的有效藥物。本研究從黃芩苷對牙周炎致病菌的抗菌作用、對促炎介質的影響、對先天免疫反應的影響和對牙周組織的保護作用等四個方面綜述使用其預防和治療牙周炎的藥理機制和療效，為在牙周疾病中應用傳統中藥黃芩苷提供參考。

1 黃芩苷的抗菌作用

牙菌斑生物膜是引起牙周炎的主要致病因素。致病菌可以激活宿主免疫細胞，產生各種促炎介質和細胞因子，破壞牙周支持組織。因此，抗菌是牙周炎預防和治療的重中之重。許多研究發現黃芩苷在抗菌方面具有突出的表現，可能的抗菌機制有：抑制核酸合成、抑制細胞膜功能、抑制能量代謝和抑制生物膜形成等[2]。Tsao等[3]研究湯劑黃芩苷對牙齦擬桿菌(B.gingivalis)、黑素原擬桿菌中間體(B.mel.ss intermedius)、具核梭桿菌(F. nucleatum)、放線菌(A.naeslundii)、放線桿菌(A.actinomycetemcomitans)、粘性放線菌(A.viscosus)等牙周致病菌的抑菌和殺菌作用，發現黃芩苷在較高濃度下對革蘭氏陰性菌的抑制效果更佳。其中，黑素原擬桿菌中間體對黃芩苷最敏感，而粘性放線菌敏感性最低。在對黃芩苷與其他抗菌藥物聯用的研究中發現，使用納米顆粒包裹以9∶1(w/w)比例組合的黃芩苷和氯己定，更能控制黃芩苷持續有效的釋放，并對含具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌和放線桿菌的混合性口腔細菌生物膜有協同抗菌作用，最低抑菌濃度(minimun inhibitory concentration，MIC)為12.5 μg/ mL[4]。Jang[5]的研究也證明了黃芩苷與氨基青霉素或慶大霉素聯用對11種口腔常見細菌具有協同殺滅作用，聯用后氨基青霉素的MIC值降低4倍，慶大霉素的MIC值降低4～8倍。

黃芩苷單獨用藥時的抗菌活性較為明確，但在與其他抗菌藥物聯用時，能否與其他藥物產生協同作用還需要進一步探索。另外，黃芩苷作為抗菌藥在使用時強調最低抑菌濃度，所以，一般以含藥牙膏或漱口水的方式用藥[6]。

2 黃芩苷對促炎介質的影響

產生促炎介質是牙周炎發展過程中必不可少的一環。一般參與炎癥反應的促炎介質有環氧合酶(cyclo-oxygen-ase，COX)、氮代謝產物、活性氧和各類細胞因子。因此，下調過度表達的促炎介質是治療牙周炎的有效措施。

2.1 前列腺素E2(PGE2)和白細胞介素(interleukin,IL)

PGE2是由活化的巨噬細胞和成纖維細胞產生的花生四烯酸環氧合酶代謝產物，是骨破壞的主要炎癥介質。李敏等[7]研究發現黃芩苷(0.01～10 μg/mL)可抑制牙周膜細胞(Periodontal ligament cells，PDLCs)中IL-1β誘導產生的PGE2。白細胞介素作為合成PGE2的增強劑，也受到黃芩苷的調節。IL-1β是一種典型的細胞因子,可在牙周組織感染狀態下引發炎癥反應[8]。IL-8對中性粒細胞的移動起著重要作用[8]。這些炎性細胞因子通過與牙周炎原體的相互作用，達到破壞牙周支持組織的效果。Chung[9]的研究發現黃芩苷濃度在1 μg/mL時，可導致單核細胞中IL-1β的分泌量減少50%以上，此外，還可減少牙齦成纖維細胞中IL-1β誘導的PGE2水平。研究者們也通過牙周炎動物模型探索了黃芩苷對白細胞介素的調節作用。Zeng等[10]在小型豬牙周炎模型中，每兩周在牙周袋內注入黃芩苷凝膠(122.4 μg/mL)，齦溝液中IL-1β的水平明顯降低。在結扎下頜第一磨牙的牙周炎大鼠模型中，黃芩苷以100 mg/kg/day的劑量喂食14 d，可減少細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA在牙齦組織中的表達[8]。但是Li等[11]發現納米粒子包封的黃芩苷在人類牙齦上皮細胞中并沒有明顯下調IL-6和IL-8的表達水平。鑒于目前的研究結果尚無一致定論，因此，還需進一步研究黃芩苷對白細胞介素的調控機制。

2.2 環氧合酶-2(COX-2)

COX-2是炎癥部位的PGE2誘導酶，以往的研究發現抑制牙周組織中COX-2的表達可改變牙周炎的病程進展，這表明COX-2在牙周炎中具有促炎作用。Cai等[12]發現黃芩苷(200 mg /kg/day)可以明顯抑制牙周炎小鼠模型中巨噬細胞、漿細胞、成纖維細胞和牙齦組織COX-2的蛋白表達。細胞學研究結果表明，黃芩苷在濃度為0.01 μg/mL時能顯著抑制人牙周膜細胞(Human periodontal ligament cells，HPLCs) 中由IL-1β誘導的COX-2 mRNA的表達水平[13]。

2.3 核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)

RANKL作為腫瘤壞死因子配體家族的一員，通過激活炎癥反應和誘導破骨細胞分化來參與牙周炎的發展，其在破骨細胞前體分化到破骨細胞過程中發揮重要作用。由成骨細胞譜系細胞產生的RANKL與骨髓細胞表面的核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)結合，RANKL-RANK信號通路激活核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及c-Myc等，從而促進破骨細胞成熟分化及行使功能[14]。細胞學研究結果表明,黃芩苷能抑制HPLCs中由IL-1β調節的RANKL mRNA表達水平，最有效的濃度為0.01 μg/mL，同時還發現IL-1β誘導的COX-2也可被黃芩苷抑制，這表明黃芩苷可能通過抑制IL-1β誘導的COX-2的表達從而抑制RANKL的mRNA表達。

3 黃芩苷對先天免疫反應的影響

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是一種I型跨膜蛋白，用于識別微生物成分并介導先天免疫反應的激活。TLR在牙周炎的病理過程中起著雙重作用。一方面，TLR可以通過對微生物的識別來激活先天免疫反應，維持牙周健康。另一方面，TLR受到長期刺激會使促炎介質水平過度升高，最終導致牙周組織的破壞。微生物脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可以利用TLR2和TLR4激活p38有絲分裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)、JNK和NF-κB通路，從而導致促炎介質的釋放進而造成牙槽骨的吸收[15]。這表明調節TLR的表達及其下游信號通路可能是治療牙周炎的另一種方法。動物實驗研究數據表明，在大鼠牙周炎模型中黃芩苷以100 mg/kg/day或更高濃度給藥，可顯著降低牙齦組織中TLR2和TLR4的表達水平，此外，黃芩苷還以劑量依賴的方式降低了MyD88的表達水平和p38 MAPK的磷酸化[16]。細胞學研究結果與動物研究結果一致。Wu等[17]用黃芩苷對金葡菌感染的成骨細胞(MC3T3-E1)進行干預，黃芩苷可抑制MC3T3-E1細胞中TLR2表達和MAPK信號通路激活，還可以提高堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨橋蛋白(osteocalcin,OCN)和 I型膠原蛋白(collagen type I，COL-I)等成骨標志物的表達水平。黃芩苷與先天免疫反應和促炎介質的相互關系如圖1所示。

圖1黃芩苷影響先天免疫反應和促炎介質的通路機制

4 黃芩苷對牙周組織的保護作用

隨著牙周炎的發展，在細菌和炎癥反應的雙重作用下牙周支持組織會遭到破壞，如結締組織的斷裂和骨吸收。因此，對損傷組織進行保護和修復也是牙周治療的目的之一。動物實驗研究發現，黃芩苷對炎癥狀態下的牙周組織有保護作用。研究人員對大鼠上頜第二磨牙的牙頸部進行結扎,并接種牙齦卟啉單胞菌4周，以誘發牙周炎。結果發現，使用100mg/kg/day或200mg/kg/day的黃芩苷治療可明顯減少因細菌感染而產生的牙槽骨吸收，改善牙周組織的形態[16]。Zeng等[10]在小型豬牙周炎模型中也發現黃芩苷能顯著提高牙周炎狀態下的牙槽骨密度和高度，還能促進牙槽骨的修復和再生。細胞學實驗研究也發現，黃芩苷對炎癥狀態下的牙周組織有保護作用。

4.1 牙周膜細胞(PDLCs)

PDLCs被認為是牙周組織再生和修復最有效的細胞來源之一，PDLCs在一定條件下具有向成骨細胞、脂肪細胞或神經源性細胞分化的潛力，其功能是負責牙周膜的形成和維護,以及鄰近牙槽骨修復、重建和再生。所以，促進PDLCs分化成骨的藥物可能對牙周炎癥組織修復有一定的價值。李昂等[18]發現黃芩苷(0.1～1 mg/L)對PDLCs中COL-I 表達有促進作用，還能顯著提高ALP的活性，促進細胞成骨分化。還有研究表明，黃芩苷在0.15～0.6 mg/L濃度范圍可以促進HPLCs增殖、基質礦化和形成鈣結節[19]。Chen等[20]研究了黃芩苷促進HPLCs成骨分化的機制，發現黃芩苷通過激活Wnt/β-兒茶素通路，上調相關因子如β-兒茶素，淋巴增強因子和細胞周期蛋白D1，促進成骨相關的轉錄因子-2(RUNX2)、骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix，OSX) 和OCN等成骨相關標志物的表達，從而提高HPLC成骨分化的能力。但該實驗的局限性在于HPLCs是一個混合細胞群，由于含有高比例的終末分化細胞，其分化潛力有限。

4.2 成骨細胞(osteoblast，OB)和破骨細胞(Osteoclast，OC)

破骨細胞與成骨細胞之間的平衡是維持正常骨量的關鍵，破骨細胞與成骨細胞相互協同，在骨骼的發育和形成過程中發揮重要作用。Guo等[21]發現黃芩苷(50 μmol/L)可以通過激活Wnt/β-兒茶素信號通路促進體外培養的成骨細胞分化，并提高OCN和COL-I等成骨分化標志物的mRNA水平。然而，在對黃芩苷干預破骨細胞的研究中發現，黃芩苷的濃度對其具有雙重效應。破骨細胞成熟分化的經典通路是RANKL和M-CSF通路[22]。Lu L等[22]研究了不同濃度下的黃芩苷對體外培養破骨細胞分化和骨吸收的雙重作用，發現10-7-10-6mol/L的黃芩苷可促進破骨細胞成熟和功能化，高劑量的黃芩苷(10-5mol/L)抑制破骨細胞的成熟。他們認為黃芩苷通過與RANK對接，激活p-ERK/Mitf信號通路來調節破骨細胞分化，破骨細胞發生標志物基因c-Fos、c-Src、NFATc1、MMP9、TRAP、CtsK和OSCAR的表達被黃芩苷上調。Lu X等[23]得出的體內體外實驗結果與前者的研究一致，同樣發現黃芩苷以濃度相關的方式對破骨細胞產生雙向調節作用。具體而言,低濃度(低于1 μmol/L)的黃芩苷增強了破骨細胞的分化和骨吸收，而高濃度(2 μmol/L以上) 的黃芩苷對破骨細胞表現出相反作用。具體機制是在低劑量時黃芩苷通過上調ERK/c-Fos/NFATc1，加強了RANKL誘導的破骨細胞成熟分化通路，造成了破骨細胞成熟分化和骨吸收，然而在較高濃度下黃芩苷不僅抑制了ERK磷酸化和c-Fos及NFATc1的表達，而且改變了凋亡相關蛋白的表達，從而抑制了破骨細胞的功能。黃芩苷對破骨細胞的影響機制如圖2所示。

圖2不同濃度黃芩苷對破骨細胞分化的影響機制

盡管實驗證實了黃芩苷對破骨細胞分化成熟的雙重作用，但現有研究并沒有完全解釋黃芩苷雙重作用的分子機制。黃芩苷的這些雙重作用表明其具有治療破骨細胞相關疾病的潛力，但需謹慎對待藥物劑量所產生的功能差異。

5 討論

本文綜述了黃芩苷預防和治療牙周炎的藥理機制和療效。大多數研究都是圍繞黃芩苷在牙周組織炎癥微環境中的分子作用機制。總之，黃芩苷可從上述四個方面控制牙周炎，它們之間的相互作用在牙周炎的預防和治療中建立了一個完整系統。黃芩苷可以通過直接抑制NF-κB的活性，下調相關的促炎介質,減少組織的氧化應激,從而控制炎癥。此外,黃芩苷還可通過對TLR信號的負調節，抑制NF-κB的活性，同時也可直接抑制IL-6和IL-8的表達。

黃芩苷表現有獨特的藥代動力學特性，包括胃腸道水解，肝腸循環，載體轉運穿過細胞膜和排泄到膽汁和尿液中。黃芩苷在體內的吸收代謝會受到其他聯用藥物的影響，因為，它們會互相競爭代謝酶和結合蛋白質。另外，某些特定的疾病也會改變轉運體和酶的功能，繼而影響黃芩苷在體內的分布與吸收。因此，使用黃芩苷時應考慮個性化方案和用藥安全性。雖然黃芩苷具有良好的穩定性和生物活性，但它們的溶解度差、半衰期短、生物利用度低，研究證明其在體內的生物利用度僅有2.2%[24]，這些因素嚴重限制了其在生物醫學方面的應用。為了解決其溶解度和生物利用度的問題，現已研究出新型黃芩苷制劑,如納米級黃芩苷載藥系統,該系統在臨床前研究中表現出了較高的吸收度。此外，局部用藥方式有望提高藥物利用率。

總之,現有的研究很大程度上支持了黃芩苷在預防和治療牙周炎中的治療作用。然而目前關于黃芩苷對牙周炎癥影響的研究還有局限性，其基本機制尚未明確，還需更進一步的研究，為臨床牙周治療提供更科學的依據。