土壤和廢水中細(xì)菌的分離以及一株變形桿菌的生理生化鑒定

瑪麗帕 吐達(dá)洪 周曉璇

【摘 要】目的：加強(qiáng)與鞏固實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株。方法：以拖把水以及校園內(nèi)土壤為材料，采用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以及血平板培養(yǎng)基對(duì)材料進(jìn)行菌株分離，并依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)分離的五株細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步生理生化鑒定。結(jié)果：經(jīng)過分離和生理生化鑒定獲得了14株菌株.并且對(duì)5株革蘭陰性桿菌進(jìn)一步生理生化鑒定，最終將菌株TR8初步確定為變形桿菌屬。結(jié)論：結(jié)果表明完全可以定期分離菌株對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室菌株進(jìn)行更新。

【關(guān)鍵詞】細(xì)菌;分離;生理生化鑒定

【中圖分類號(hào)】R282.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2020）06--01

快速、準(zhǔn)確的微生物鑒定工作，對(duì)正確處理和控制公共衛(wèi)生事件具有重要意義.因此，微生物檢驗(yàn)室必須保藏一批形態(tài)、生物化學(xué)、血清學(xué)特性穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株.如果保藏方法及管理不善，菌種優(yōu)良特性便會(huì)退化、喪失甚至導(dǎo)致死亡，就會(huì)影響菌種鑒定[1].而作為學(xué)習(xí)微生物鑒定的基礎(chǔ)檢驗(yàn)專業(yè)教學(xué)過程中，標(biāo)準(zhǔn)菌種是最基本的材料之一，定期檢查菌種，保存期檢定菌種的新陳代謝處于最低水平，易發(fā)生變異和死亡。控制傳代次數(shù)越多，變異的機(jī)率越大，因此要盡量控制傳代次數(shù)限度或經(jīng)鑒定檢查不合格的，應(yīng)銷毀滅活，并做記錄。本校檢驗(yàn)專業(yè)微生物教研室長(zhǎng)期以來自行保存菌株活化備用，有些重要的菌種出現(xiàn)老化，死亡的現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)為了做好菌種的保存以及教學(xué)過程的質(zhì)量保證，尤其是腸桿菌科鑒定實(shí)驗(yàn)中變形桿菌的常規(guī)檢驗(yàn)方面缺少標(biāo)株，因此從校園土壤以及拖把水中分離不同的細(xì)菌進(jìn)行純化以及生理生化鑒定，為中職檢驗(yàn)班學(xué)生提供微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 取樣：采自伊寧衛(wèi)校校園花園中的深層土壤。培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，血平板培養(yǎng)基，配方參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。生理生化反應(yīng)試劑：1%鹽酸對(duì)氨基二甲基苯胺水溶液、2%硝酸水溶液、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液、盧戈氏碘液、結(jié)晶紫液、甲基紅試劑、格里斯氏試劑、二苯胺試劑、鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.2 方法

1.2.1 取樣：從新疆伊寧衛(wèi)校花園中的深層土壤以及拖把水中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)取樣方法進(jìn)行取樣。

1.2.2 土壤中細(xì)菌的分離純化：將采集的土壤和拖把水樣品用生理鹽水將培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋分別以原始濃度（稀釋為）10-1、10-3、10-5在三組固體培養(yǎng)基上接種，并用玻璃棒均勻涂布營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以及血平板培養(yǎng)基上。將接種后的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度36～38℃，培養(yǎng)1～2天。從平板上挑取形態(tài)顏色不同的單菌落，繼續(xù)在新的平板上劃線純化2～3次，獲得純培養(yǎng)物，給菌株編號(hào)。

1.2.3 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察[3]

1.2.3.1 簡(jiǎn)單染色：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。進(jìn)行染色，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色約1 min，水洗。最后鏡檢，干燥后用油鏡觀察。

1.2.3.2 革蘭氏染色：取菌種培養(yǎng)物涂片、干燥、固定、結(jié)晶紫初染、碘媒染、乙醇脫色、稀釋復(fù)紅復(fù)染。

1.2.3.3 芽孢染色法：將培養(yǎng)24小時(shí)左右的菌株作涂片、干燥、固定。滴加孔雀綠染液于已固定的涂片上，用飽和的孔雀綠水溶液染10分鐘。用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無色。待干燥后，置油鏡觀察。

1.2.3.4 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察：壓滴法即直接用載玻片滴一滴生理鹽水后挑取活菌涂片，蓋玻片小心蓋住，鏡下觀察結(jié)果，有鞭毛的細(xì)菌有動(dòng)力。

1.2.4 細(xì)菌生理生化鑒定方法：利用氧化酶的測(cè)定（Kovacs氏法）、 觸酶的測(cè)定 、基紅實(shí)驗(yàn)（M.R實(shí)驗(yàn)）、酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）、淀粉水解試驗(yàn)來進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果：利用細(xì)菌分離方法分離出形態(tài)及顏色有差異的14株菌株。根據(jù)細(xì)菌平板上特性以及染色結(jié)果顯示，分離出7株革蘭陽性桿菌，5株革蘭陰性桿菌，1株革蘭陰性球菌及1株革蘭陽性球菌。

2.3 細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果：對(duì)14株分離菌進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)、觸酶實(shí)驗(yàn)、M.R實(shí)驗(yàn)、V.P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與伯杰手冊(cè)中的相似菌株一致。

2.4 G-桿菌鑒定試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)生理生化反應(yīng)結(jié)果，G-桿菌五株細(xì)菌 TR4、TR6、TB3、TB6、TR8菌株進(jìn)一步在KIA培養(yǎng)基以及MIU培養(yǎng)基中接種，其具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

3 分析與討論

在所分離的14株細(xì)菌中，菌株 TR4、TR6、TB3、TB6、TR8、TB8為G-桿菌，因當(dāng)下實(shí)驗(yàn)室變形桿菌屬嚴(yán)重污染，而且生理生化反應(yīng)有所變異，所以特此將分離出的G-桿菌進(jìn)一步在克氏雙糖鐵（KIA）培養(yǎng)基以及動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素（MIU）培養(yǎng)基中接種，結(jié)果顯示菌株TR4、TR6、TB3、TB6所有生理生化反應(yīng)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中埃希菌屬分類標(biāo)準(zhǔn)一致，初步鑒定為埃希菌屬。菌株TR8所有生理生化反應(yīng)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中變形桿菌屬分類標(biāo)準(zhǔn)一致，初步鑒定為變形桿菌屬。變形桿菌TB8以及埃希菌屬TR4、TR6、TB3、TB6的分離對(duì)于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物檢驗(yàn)課程中的《腸道桿菌的分離鑒定》一章實(shí)驗(yàn)課程提供了最好的實(shí)驗(yàn)材料，菌株TR1、TR2、TR3、TR4、TR6、TR7、TR8、TR9、TR11、TB1、TB3、TB4、TB6、TB7為《常見革蘭陽性兼性厭氧桿菌的檢驗(yàn)》一章實(shí)驗(yàn)課程提供有效的菌株，尤其是變形桿菌已在實(shí)驗(yàn)室接近死亡，因此該菌的分離為實(shí)驗(yàn)室短缺的菌株填補(bǔ)空白。

菌株TB1為G- 球菌，疑似奈瑟菌屬，但形態(tài)學(xué)及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與奈瑟菌屬有明顯差異，需要進(jìn)一步做生理生化鑒定以及細(xì)菌基因序列鑒定。菌株TB7在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生金黃色色素，色素在細(xì)菌生長(zhǎng)3-5天顏色明顯加深，這株菌的色素分離鑒定有待研究。

參考文獻(xiàn)

劉曉嬌.拮抗放線菌對(duì)煙草黑脛病的控病研究[D].西南大學(xué)，2011

王霞，薛林貴等.菘藍(lán)內(nèi)生細(xì)菌的分離、篩選及鑒定[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（3）：163-169

王平宇、張樹華.硅酸鹽細(xì)菌的分離及生理生化特性的鑒定[J].南昌航空工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，79-82

布坎南RE，吉本斯NE 著;中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組譯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè).第8版.北京：科學(xué)出版社，1984