基于TGF-β1/Smad3信號通路觀察促血小板生成素對阿霉素致心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

牛 歡，陳曼麗，楊 波，何智余

(1.深圳大學總醫院 心血管內科， 廣東 深圳 518005； 2.深圳市寶安區婦幼保健院 內科， 廣東 深圳 518000； 3.蘭州大學第一醫院 心血管內科， 蘭州 730000)

原發性以及繼發性的心血管疾病的終未期主要表現為心室充盈或射血功能受損，被稱為慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)[1]，至今尚無根治性治療手段。據統計CHF的5年生存率不足50%。目前CHF的發病機制已逐漸深入到分子生物學水平，為CHF的基因靶向治療提供有力支撐[2]。研究表明[3]心肌纖維化導致的心室重構(ventricular remodeling,VR)進而造成心肌細胞的異常凋亡是CHF發生、發展過程中關鍵性的病理改變。Chang等[4]研究證實抑制心肌纖維化，能降低心肌細胞的凋亡率，減輕心力衰竭的程度。已有的實驗研究表明[5]轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)直接參與心肌纖維化的病理過程。研究顯示TGF-β1可促進成纖維細胞(cadiacfibloblast,CFs)轉化。CFs的增生刺激分泌細胞外基質(extra cellular matrix,ECM)蛋白，引起心肌組織膠原纖維積聚，進而改變心肌的基礎空間結構，造成心肌細胞異常凋亡、壞死數量增加，導致心臟功能障礙。Heger等[6]研究證實TGF-β1能夠促進大鼠心肌細胞的凋亡。促血小板生成素(thromobopoietin, TPO)是機體內調節血小板/巨核細胞系的最重要的造血蛋白生長因子，臨床應用就是作為造血生長因子用于血小板減少癥的治療。近年來研究發現TPO對心臟具有保護作用[7]。張東濤等[8]體外研究H9C2細胞發現， TPO通過抑制細胞凋亡實現對體外心肌細胞的保護作用，但TPO在CHF中作用的報道較少。本研究通過建立大鼠CHF模型，從TGF-β1/Smad3的角度探討TPO對CHF的保護作用，從而為臨床上TPO的應用提供。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

48只8-10周SPF級SD雄性大鼠，體重220～250 g，[SCXK(甘)2018-0002]，[SYXK(甘)2018-12]，由深圳大學總醫院實驗動物中心提供；室溫下標準飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應性飼養一周后用于實驗。實驗動物的使用及操作均遵守3R原則，在過程中給與與動物人道的關懷，實驗基本操作參照深圳大學總醫院動物管理委員會關于基礎實驗動物的的規定進行，并經本院實驗動物管理倫理委員會批準(JG-2019-0047)。

1.2 主要試劑與儀器

促血小板生成素注射液(thrombopoietin，TPO，沈陽三生制藥有限公司，批準文號：國藥準字：S20050048)；阿霉素(注射用鹽酸多柔比星，山西普德藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H14023879)；TGF-β1特異性抑制劑SB431542(生產批號：1014-JA)采購自美國Selleck公司，異氟烷(生產批號：521 L -A)、戊巴比妥鈉(生產批號：256O-0I)、鏈脲佐霉素(生產批號：AS-7802)、多聚甲醛(生產批號：WQ-2F)采購自Sigma公司；HE試劑盒(生產批號：KT-2018H567)、Masson染色試劑盒(生產批號：KT-2018M902)購自上海碧云天生物技術公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(生產批號：GW-147)、化學發光試劑盒(生產批號：GW-1857)購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；TGF-β1(生產批號：AY-T201)、p-Smad3抗體(生產批號：AY-S269)、兔抗大鼠Caspase-3(生產批號：AY-C5TH)、兔抗GAPDH(生產批號：AY-GT34)以及山羊抗兔IgG(生產批號：AY-IJ70)采購自美國abcam公司，TUNEL試劑盒(生產批號：RN-S069)、Western blot試劑盒(生產批號：RN-WR672)購自德國Rebstock公司。

熒光顯微鏡(US-2018，尼康公司，日本)，Bio-rad凝膠成像系統(8845-S型，Bio-rad公司，美國)，-80℃深冷冰箱(WF-150 V，維根斯公司，德國)，電鏡(KW-06，三菱公司，日本)，組織切片機(Leica RM2135，Leica公司，德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構建和分組處理

實驗前使用標準醫用生理鹽水將注射用阿霉素配成2 mg/L溶液，將48只大鼠隨機分為4組，每組12只，分別為對照組、模型組、TPO干預組(治療組)、TGF-β1特異性抑制劑SB431542干預組(抑制劑組)；據文獻方法[9]，將阿霉素溶液分別以7 mg/kg腹腔注射到模型組、治療組、抑制劑組大鼠體內，每周1次，持續8周，構建心力衰竭大鼠模型；對照組大鼠腹腔注射等體積的醫用生理鹽水。8周后采用心臟彩超記錄鼠心功能指數。同時開始進行藥物干預治療，治療組大鼠每日腹腔注射給藥5 μg/kg TPO； 抑制劑組大鼠每日腹腔注射給藥1.2 mg/kg SB431542；對照組、模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，持續給藥28 d。

1.3.2 心臟超聲檢査心臟功能

持續給藥28 d后，異氟烷腹腔注射麻醉大鼠，固定于手術臺，心臟彩超檢查心臟功能。記錄左室射血分數(LVEF)、左室收縮期內徑(LVDS)、舒張期內徑(LVDd)、短軸縮短率(FS)等數據。

1.3.3 各組大鼠心肌組織病理學改變

檢查心臟彩超之后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈放血處死。在無菌操作臺上，開胸取出心臟，用無菌濾紙吸干水分，處理過后將心臟組織封存在液氮中，置于-80℃深冷冰箱中備用。取出20%心肌組織，分別用HE染色和Masson染色，制成切片，光鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理改變。

1.3.4 免疫組化法檢測心肌組織測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達

取出20%心肌組織，固定包埋并切片，脫蠟后，檸檬酸鹽緩沖液修復，3%的雙氧水室溫下封閉，分別加入一抗，4℃過夜孵育，次日，PBS沖洗3次后，分別加入二抗，清洗。加適量二氨基聯苯氨 (diaminobenzidin ，DAB)顯色，蘇木素復染，乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果；每個樣本獨立重復測量3次。

1.3.5 TUNEL染色檢測各組大鼠心肌細胞凋亡

取10%心肌組織，常規方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗兩次，梯度酒精浸洗5 min，風干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃預冷乙醇上進行如下操作：0.1% TRItonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS漂洗，脫水后二甲苯透明，封片，US-2018熒光顯微鏡進行觀察。

1.3.6 免疫熒光檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3的表達情況

從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，常規方法固定，冰凍切片，按照免疫熒光的試劑盒要求進行操作觀察Caspase-3的表達情況。

1.3.7 Western blot檢測各組大鼠腦組織中Caspase-3以及信號通路相關蛋白TGF-β1、p-Smad3的表達水平

從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，組織裂解勻漿器，冰浴5 min后離心，留取上清，測定蛋白濃度后，電泳轉移膜，封閉加入一抗稀釋液(均為1∶1000)，保持4℃過夜，次日清洗后，加入二抗稀釋液(均為1∶10000)，室溫下孵育2 h，顯色后Bio-rad凝膠成像儀下讀取各條帶的灰度值， 目的蛋白相對表達水平以GAPDH作為參照。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 心臟彩超檢測大鼠心功能的變化

各組大鼠心臟彩超檢測各組大鼠心功能后結果如圖1，表1所示，與對照組相比，模型組大鼠的LVDS、LVDd明顯出現升高(P<0.05)，LVEF、FS明顯出現下降(P<0.05)，與模型組相比，治療組、抑制劑組的LVDS、LVDd明顯下降(P<0.05)，LVEF、FS明顯升高(P<0.05)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。治療組、抑制劑組在大鼠心臟心功能指數差異不具有統計意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學

HE染色結果如圖2所示，對照組大鼠心肌細胞結構完整，清晰可辨，細胞整齊排列，細胞間質無水腫情況，心肌橫紋清晰且規則，細胞連接緊密。模型組大鼠心肌細胞肥大且不規則、細胞排列紊亂，心肌濁腫明顯，細胞間質水腫明顯及細胞外基質增多，可見大量炎性細胞浸潤，纖維增生明顯，心肌細胞間質充血嚴重，心肌橫紋消失；與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠心肌細胞較模型組排列更規則，心肌纖維變性較輕，纖維組織增生明顯減少，基本無出血點，心肌細胞損傷癥狀明顯減輕。

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。圖1 各組大鼠心臟超聲結果Note. A， control group. B， model group. C， treatment group. D, inhibitor group.Figure 1 Cardiac ultrasound results of rats in each group

表1各組大鼠心功能指數比較

Table1Comparison of the heart function index of rats in each group

分組Groups左室收縮期內徑(mm)LVDS舒張期內徑(mm)LVDd左室射血分數(%)LVEF短軸縮短率(%)FS對照組control group5.01±0.353.47±0.1684.14±1.5255.25±0.38模型組model group7.65±0.27*5.85±0.18*62.15±2.15*28.49±0.63*治療組treatment group6.21±0.13#4.35±0.11#75.05±3.26#38.35±0.87#抑制劑組 inhibitor group6.18±0.15#4.33±0.13#75.15±3.14#37.18±1.28#

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the control group.*P<0.05. Compared with the model group.#P<0.05.

注：A:對照組;B：模型組;C：治療組;D:抑制劑組。圖2 HE染色結果Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group.Figure 2 HE staining

注：A:對照組;B：模型組;C：治療組;D:抑制劑組。圖3 Masson染色結果Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group.Figure 3 Masson staining

光鏡下觀察大鼠心肌細胞Masson染色，心肌細胞呈現紅色，膠原纖維呈現藍色，本研究中Masson染色結果如圖3所示，對照組只是少量的膠原纖維散在細胞間隙中；模型組心肌細胞及血管周圍均可見大片藍色的心肌膠原纖維分布；與模型組相比，治療組、抑制劑組心肌細胞及血管周圍的膠原纖維明顯減少。

2.3 免疫組化法檢測心肌組織測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達

免疫組化結果如圖4所示：與對照組相比，模型組、治療組、抑制劑組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達均出現明顯的升高(P<0.05)。與模型組相比，在進行藥物干預后，治療組、抑制劑組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達出現明顯的下降(P<0.05)，治療組、抑制劑組在大鼠心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達差異不具有統計意義(P>0.05)。推斷促血小板生成素和抑制劑SB431542均可抑制心衰大鼠心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。

2.4 TUNEL染色檢測各組大鼠心肌組織中的細胞凋亡

TUNEL染色結果如圖5所示，與對照組相比，模型組大鼠的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，治療組和抑制劑組相比，細胞凋亡率的差異(P>0.05)，不具有統計學意義。

2.5 免疫熒光檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3的表達情況

Caspase-3作為細胞程序性凋亡的最終執行分子。本研究中免疫組化和Western blot結果如圖6所示，與對照組相比，模型組Caspase-3的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組、抑制劑組Caspase-3的表達明顯降低(P<0.05)；治療組和抑制劑組相比，大鼠心肌組織Caspase-3表達差異(P>0.05)，不具有統計學意義。

注：A:對照組;B：模型組;C：治療組;D:抑制劑組。a:Ⅰ型膠原蛋白；b:Ⅲ型膠原蛋白。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖4 免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達結果Note. A， control group. B， model group. C， treatment group. D， inhibitor group. a, type I collagen. b, type III collagen. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 4 Immunohistochemical staining of type I and III collagen

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖5 TUNEL染色檢測心肌組織中的細胞凋亡Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group. Compared with the control group,*P < 0.05. Compared with the model group,#P < 0.05.Figure 5 TUNEL staining for the detection of cell apoptosis in myocardial tissue

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。a：免疫組化檢測各組大鼠心肌組織Caspase-3的表達；b：Western blot檢測各組大鼠心肌組織Caspase-3的表達；c：各組大鼠心肌組織中Caspase-3的表達差異。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖6 各組大鼠心肌組織中的Caspase-3的表達Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group.a， Immunofluorescence detection of the expression caspase-3. b, Western blot detection of the expression of caspase-3. c, Difference in the expression of caspase-3. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05. Figure 6 Expression of Caspase-3 in myocardial tissue of rats in each group

2.6 Western blot檢測TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達

本研究采用Western blot檢測各組大鼠心臟組織TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達，結果如圖7所示，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞的TGF-β1、p-Smad3的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠心肌細胞的TGF-β1、p-Smad3的表達明顯降低(P<0.05)。治療組、抑制劑組在大鼠心臟心肌細胞TGF-β1、p-Smad3表達差異不具有統計意義(P>0.05)。

注：A:對照組；B：模型組；C：治療組；D:抑制劑組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖7 Western blot檢測各組大鼠心臟組織TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達Note. A, control group. B, model group. C, treatment group. D, inhibitor group. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.Figure 7 Western blot detection of the expression of TGF-β1 and p-Smad3 proteins

3 討論

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是以心臟收縮或舒張功能障礙為標志的器質性心血管系統的綜合癥[10]，死亡率高，預后不佳。近年來，隨著研究的深入，許多學者從形態學、分子生物學等角度研究證實心肌細胞凋亡是CHF發生、發展中的重要生理病變過程。

細胞異常凋亡致使心肌細胞數量驟減，心室充盈壓失常、心房排血量減少，最終導致心室壁變薄，心腔擴大，心肌肥大等心肌重構(Ventricular remodeling,VR)發展成CHF[11]。促血小板生成素(thromobopoietin, TPO)具有介導血小板生成和調節巨核細胞增殖、分化的功能[12]。近年來研究發現TPO還能在其他系統發揮作用[13]。王曉東等[14]研究發現TPO能促進小鼠神經細胞的增殖，穩定線粒體膜電位，發揮抗凋亡的作用。Besbes等[15]研究發現TPO能夠影響卵巢細胞的增殖和凋亡。而TPO對心血管系統的保護作用引起關注[16]。Wang等[17]TPO能保護H9C2細胞免受多柔比星誘導的細胞自噬，發揮心肌細胞保護的作用。Chan等[18]采用TPO 治療心梗大鼠發現TPO能明顯改善其左心室功能，促進血管新生，減小心梗面積。但是TPO 在CHF中的作用未見有研究報道。

阿霉素(adriamycin)是一線抗腫瘤化療藥物，但是由于其心臟毒性，限制了在臨床上的應用[19]。本研究中在給與阿霉素8周后，大鼠心臟LVDS、LVDd明顯升高，LVEF、FS明顯降低，與人CHF癥狀相似。CHF大鼠模型建立成功。阿霉素造成CHF的機制上不明確，有研究報道[20]證實大鼠在注射阿霉素后，導致心肌細胞凋亡，致使心肌細胞數量驟減，心臟結構發生改變，心室功能降低。本研究中模型組大鼠心臟LVDS、LVDd明顯升高(P<0.05)，LVEF、FS明顯降低(P<0.05)，心肌細胞及血管周圍均可見心肌膠原纖維沉積，心肌CHF損傷癥狀明顯；細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。細胞凋亡是有許多分子共同調控的結果，Caspase-3是凋亡過程中的最重要的效應蛋白[21]。模型組大鼠心肌細胞Caspase-3的表達明顯升高。在經過TPO治療后，治療組大鼠心臟功能明顯改善，心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；治療組大鼠心肌細胞及血管周圍的膠原纖維明顯減少，心肌細胞CHF損傷癥狀明顯減輕。由此可推斷促血小板生成素能夠抑制有阿霉素導致的心肌凋亡，改善心臟功能。

TGF-β1主要在成纖維細胞、上皮細胞和平滑肌細胞中表達，TGF-β1是激活成纖維細胞的關鍵因子，可刺激膠原纖維的合成[22]。研究表明[23]TGF-β1/ Smad3信號通路在心臟重塑和CHF的過程中發揮關鍵性的作用。研究證實[24]抑制TGF-β1的作用能夠有效的抑制由糖尿病等導致的CHF的中的心室重構；動物實驗研究證實[25]在心肌梗死早期抑制TGF-β1信號通路，能夠明顯改善心功能。本研究中免疫組化結果顯示，模型大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達均明顯升高，在使用TPO和TGF-β1抑制劑干預后，治療組、抑制劑組大鼠心肌膠原纖維表達明顯下降，兩組大鼠CHF病理指標改善差異不明顯，初步推斷TPO可能通過抑制說TGF-β1的表達來改善大鼠CHF癥狀。進一步研究發現，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞的TGF-β1、p-Smad3的表達明顯升高；與模型組相比，治療組、抑制劑組大鼠心肌細胞的TGF-β1、p-Smad3的表達明顯降低，推斷TPO 能抑制說TGF-β1的表達。

綜上所述，TPO能夠改善由阿霉素導致CHF大鼠的心臟功能，降低心肌細胞凋亡率，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關。雖然TPO對心臟的保護作用在動物實驗中效果令人欣慰，但是就TPO在臨床上治療心力衰竭的安全性、用藥的最佳時間、以及最佳劑量等問題還需要進一步研究。