miR-155-5p對急性髓系白血病細胞凋亡的影響及可能機制

鄧之奎， 朱偉

(1. 江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013； 2. 淮安市第一人民醫院血液科實驗室， 江蘇 淮安 223300)

近年來，隨著化療、造血干細胞移植、免疫治療、分子靶向治療等技術的進步，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者大多能獲得完全緩解，標準的一線誘導化療方案能夠使60%～80%的年輕患者以及40%～60%的老年患者獲得緩解，然而，仍有60%的患者緩解后面臨復發的風險[1]。耐藥是AML患者治療失敗、生存率低的關鍵因素[2]，然而AML耐藥的確切機制尚不完全明確。近年來，AML耐藥機制的研究主要集中在耐藥相關蛋白及酶異常、基因突變、miRNAs的改變以及耐藥相關信號通路的異常活化[3]。本研究以AML患者骨髓單個核細胞(BMMNC)以及AML細胞系為研究對象，探討miR-155-5p對AML細胞凋亡的影響及可能機制，為臨床克服AML患者化療耐藥、提高療效提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 BMMNC采集

收集本院2016年1月至2018年12月43例AML患者，診斷標準參照WHO急性白血病臨床分型(2016)，所有患者均經細胞形態學、免疫分型、細胞遺傳學和分子學(MICM)確診。患者的中位年齡36(18～75)歲，男24例，女19例。采用Ficoll密度梯度離心法分離出BMMNC，分裝至1.5 mL EP管內(每管細胞數約1×106)，保存于-80 ℃低溫冰箱。對照組為21例缺鐵性貧血患者。標本采集經淮安市第一人民醫院醫學倫理委員會批準，并獲得患者本人知情同意。

1.2 細胞系及培養

HL-60、THP-1細胞系購于美國ATCC細胞庫(美國Virginia公司)，用含有10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養基(美國Invitrogen公司)于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養，每隔48～72 h換培養液1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 試劑

Bcl-2抗體(美國Proteintech公司)；NF-κB(p65)抗體、β-肌動蛋白抗體、羊抗鼠IgG-HRP抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體(美國Cell signaling Technology公司)；ECL檢測發光試劑盒(美國Bioworld Technology公司)；細胞凋亡試劑盒(德國MiltenyiBiotec公司)；總蛋白提取試劑盒(南京諾唯贊公司)；qRT-PCR相關的逆轉錄及擴增試劑盒(中國Vazyme公司)；PVDF膜(中國凱基生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁生物科技有限公司)；miR-155-5p轉染試劑盒(上海生工生物科技有限公司)。

1.4 qRT-PCR檢測BMMNC中miR-155-5p和Bcl-2 mRNA的表達

Trizol法提取BMMNC的總RNA，通過逆轉錄試劑盒，Oligo引物及逆轉錄酶將總RNA逆轉錄為cDNA。miR-155-5p特異引物為5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′；Bcl-2上游引物為5′-CCCCACAGTCTACTGTAAG-3′，下游引物為5′-GCATTGCCGATGGTACTGATT-3′；β-肌動蛋白上游引物為5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物為5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。定量PCR(美國應用生物系統公司7300擴增儀)反應程序為95℃ 3 min，95℃ 30 s，40個循環，62℃ 40 s。擴增結果以β-肌動蛋白作為內參基因，采用ΔΔCt法計算相對定量。

1.5 細胞轉染

miR-155-5p類似物：5′-GAUAGUUCGGUGUGCACA-3′,miR-155-5p類似物對照:5′-AUGGUCGUUAAGCCAGUG-3′；miR-155-5p抑制劑：5′-CGGAUAUGUGCAGUGCUA-3′,miR-155-5p 抑制劑對照：5′-AGGCAGUGUCGUCAAUUG-3′。依據轉染試劑盒說明書，取對數生長期的HL-60、THP-1細胞分別接種于6孔板，次日細胞匯合度達30%～50%時，加入混勻后的脂質體2000和miR-155-5p類似物或抑制劑，室溫孵育30 min，置于37℃、5%CO2的孵育箱中轉染6 h后換液，繼續培養48 h。qRT-PCR驗證轉染效率，方法同步驟“1.4”。

1.6 CCK-8法檢測HL-60和THP-1轉染細胞的活性

取轉染后處于對數生長期的HL-60、THP-1細胞，以4×104/mL的密度接種于96孔培養板中，每孔體積為100 μL。加入不同濃度的化療藥物阿糖胞苷(終濃度為0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64和1.28 μg/mL)，置于37℃、5% CO2的培養箱中孵育48 h，棄去上清液，每孔中加入100 μL PBS和10 μL的WST-8試劑，避光37℃溫箱孵育2 h后用酶標儀檢測光密度(D)值，檢測波長為480 nm。每個濃度設置3個復孔。

1.7 流式細胞術檢測HL-60和THP-1轉染細胞的凋亡率

將轉染后的HL-60、THP-1細胞以每孔1×105個的密度接種于6孔板中，各設3個復孔，待細胞貼壁后，加入阿糖胞苷(0.16 μg/mL)處理48 h后，用酶消化法收集細胞于1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌1次，每管加入200 μL結合液、5 μL Annexin V試劑和10 μL PI試劑，避光室溫孵育10 min后置于冰上。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 qRT-PCR法檢測轉染miR-155-5p抑制劑后HL-60和THP-1細胞NF-κB、Bcl-2的mRNA表達

Trizol法提取轉染miR-155-5p抑制劑后HL-60和THP-1細胞的總RNA，通過逆轉錄試劑盒，Oligo引物及逆轉錄酶將總RNA逆轉錄為cDNA。NF-κB上游引物為5′-CCTATGTGGAGATCATTGAGCA-3′，下游引物為5′-CAAAGATGGGATGAGAAAGGAC-3′；Bcl-2上游引物為5′-CCCCACAGTCTACTGTAAG-3′，下游引物為5′-GCATTGCCGATGGTACTGATT-3′；β-肌動蛋白上游引物為5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物為5′-GCTGGAAGGTGGACA GCGA-3′。定量PCR(美國應用生物系統公司7300擴增儀)反應體系：上下游引物各1 μL、Taq DNA聚合酶12.5 μL、模板cDNA 2 μL、去離子水8.5 μL，總反應體系25 μL。擴增條件：95℃預變性3 min，94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環，72℃ 5 min。擴增結果以β-肌動蛋白作為內參基因，采用ΔΔCt法計算相對定量。

1.9 蛋白質印跡法檢測轉染miR-155-5p抑制劑后HL-60和THP-1細胞NF-κB、Bcl-2的蛋白表達

6孔板每孔用1 mL PBS洗滌1次，置于冰上，每孔加入70 μL含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，細胞刮刀順同一方向將轉染miR-155-5p抑制劑后的AML細胞輕輕刮下，吸取每孔中的蛋白裂解液至1.5 mL EP管中，振蕩器振蕩混勻1 min，置于冰上10 min后繼續振蕩1 min，重復3次，4℃、12 000×g離心15 min后吸取上清液至新EP管中，按照4 ∶1的比例加入5×上樣緩沖液，水浴煮沸8 min，-20℃短期保存。取50 μg蛋白質為上樣量，先經80 V恒壓電泳，當蛋白進入積層膠時將電壓調至100 V恒壓電泳，待蛋白跑至膠底部后以350 mA恒流電轉2 h，將PVDF膜浸于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入一抗(NF-κB、Bcl-2、β-肌動蛋白，稀釋比例1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。次日以TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1 ∶2 000)，37 ℃溫育1 h，最后，加入Millipore的曝光液(A液和B液按1 ∶1的比例混合)，采用化學發光凝膠成像系統進行檢測。

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表達

qRT-PCR結果顯示AML患者較缺鐵性貧血患者BMMNC的miR-155-5p和Bcl-2 mRNA表達明顯升高(圖1)。

圖1 miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表達

2.2 miR-155-5p對阿糖胞苷處理的HL-60和THP-1細胞活性和凋亡的影響

HL-60細胞轉染miR-155-5p類似物或抑制劑后，qRT-PCR檢測轉染效率，miR-155-5p表達較對照組有明顯差異(F=124.7，P<0.01)，見圖2A。CCK-8及流式檢測結果顯示轉染miR-155-5p類似物的HL-60細胞經阿糖胞苷處理后細胞活性較對照組增加，細胞凋亡率明顯減少(t=6.806,P<0.01)；而轉染miR-155-5p抑制劑組細胞活性降低，凋亡率明顯增加(t=3.790,P<0.01)，見圖2B、C。qRT-PCR檢測THP-1細胞轉染miR-155-5p類似物或抑制劑轉染效率，miR-155-5p表達較對照組有明顯差異(F=295.3，P<0.01)，見圖3A。阿糖胞苷處理后轉染miR-155-5p類似物的THP-1細胞活性增強，凋亡率減少(t=4.487,P<0.01)；轉染miR-155-5p抑制劑的THP-1細胞活性降低，凋亡率增加(t=16.01,P<0.01)，見圖3B、3C。

圖2 miR-155-5p對阿糖胞苷處理的HL-60細胞活性和凋亡的影響

圖3 miR-155-5p對阿糖胞苷處理的THP-1細胞活性和凋亡的影響

2.3 抑制miR-155-5p后HL-60和THP-1細胞NF-κB、Bcl-2表達減少

qRT-PCR和蛋白質印跡結果顯示，HL-60細胞轉染miR-155-5p抑制劑后，NF-κB、Bcl-2在mRNA水平與蛋白水平的表達均下降(P均<0.05)，見圖4A、4B。用THP-1細胞重復上述實驗進行驗證也發現同樣的結果(P均<0.05)，見圖4C、4D。表明miR-155-5p可能通過上調NF-κB、Bcl-2抑制AML細胞凋亡。

圖4 抑制miR-155-5p對HL-60、THP-1細胞NF-κB、Bcl-2表達的影響

3 討論

研究發現miRNAs主要通過調控DNA損傷、細胞周期以及細胞凋亡等介導腫瘤耐藥[4-6]。研究表明，miR-155在多種腫瘤組織中表達異常，并與臨床病理標志物、腫瘤分型和較低的存活率相關，能夠介導多種信號通路，包括NF-κB信號通路，NF-κB可直接結合miR-155的啟動子調控miR-155的表達。miR-155參與多種生理學過程，包括造血細胞分化、免疫反應、炎癥以及腫瘤治療耐藥[7-8]。miR-155在多種實體腫瘤的發病機制中起著至關重要的作用，Bayraktar等[7]通過對乳腺癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌6個實體腫瘤的540個樣本的miRNA表達譜進行分析，發現miR-155的表達在乳腺癌、肺癌和結腸癌樣本中上調，并可促進包括乳腺癌和肺癌在內的幾種癌癥的腫瘤細胞生長、細胞遷移、侵襲以及上皮間質轉化。

miR-155除了在實體瘤的發生及耐藥中發揮重要作用外，也參與多種血液腫瘤的發病及耐藥。miR-155是血液系統腫瘤最具有特征性的致癌miRNA，包括彌漫大B細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、合并FLT3-ITD基因突變的AML[9-12]。高表達的miR-155可以顯著增強腫瘤細胞活性，同時降低白血病細胞對化療藥物的敏感性[7]。研究證實miR-155在成人與兒童AML中高表達，特別是FLT3-ITD突變的AML，且高表達miR-155的AML患者預后較差[13]。本研究通過分析AML患者臨床樣本發現miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中表達明顯增高。

為了進一步驗證miR-155-5p在AML細胞生長及凋亡中的作用，在AML細胞系中，分別轉染miR-155-5p類似物與miR-155-5p抑制劑，發現轉染miR-155-5p類似物組細胞活性增加、凋亡減少，而轉染miR-155-5p抑制劑組細胞活性降低、凋亡增加，提示miR-155-5p可以提高AML細胞活性、抑制其凋亡。同時，在轉染miR-155-5p抑制劑的AML細胞中，NF-κB、Bcl-2的mRNA和蛋白水平表達均降低，提示miR-155-5p促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，并抑制AML細胞凋亡。

綜上，本研究結果顯示miR-155-5p、Bcl-2在AML患者BMMNC中高表達，在AML細胞中miR-155-5p可以促進AML細胞對阿糖胞苷的抗性、抑制其凋亡，miR-155-5p可能通過促進NF-κB、Bcl-2的表達抑制AML細胞凋亡。因此，miR-155-5p或可作為提高AML治療效果的分子靶標。