OmpR對傷寒沙門菌巨噬細胞內生存能力的影響

魏丹丹， 謝中藝， 楊帆帆， 林立萍， 黃新祥， 張盈

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S. Typhi)屬于腸桿菌科沙門菌屬，人類是其唯一的感染宿主[1]?？山浖S口途徑傳播感染人體引起消化系統感染，緊接著S. Typhi侵入腸壁淋巴組織并沿著淋巴管進入腸系膜淋巴組織，并被巨噬細胞吞噬，S. Typhi能夠在巨噬細胞內存活和增殖，通過淋巴液及血液循環擴散到全身造成系統性感染[2]。

OmpR是雙組分調節系統EnvZ/OmpR中的調節蛋白，磷酸化的OmpR參與許多信號傳導[3]。研究表明，OmpR對酸應激、滲透壓調節、上皮細胞侵襲能力等有重要意義[4]，并且也是細菌氧化應激調控網絡的一部分[5]。EnvZ/OmpR雙組分系統也可通過沙門氏菌致病島2(SalmonellaPathogenicity Island-2，SPI-2)調控Ⅲ型分泌系統(T3SS)的表達，從而影響細菌的毒力[6]。本研究利用ompR基因缺陷株(ΔompR)及回補株(C-ΔompR)，探討OmpR對S. Typhi巨噬細胞內生存能力的影響，并通過分析OmpR對細菌巨噬細胞內生存能力相關的SPI-2中3個操縱子首基因ssrA、ssrB和spiC的調控關系來研究其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒S. Typhi野生株GIFU10007(WT)由日本岐阜大學醫學院微生物學教研室饋贈；S. Typhi空載體對照株(WT-pBAD33)，ompR缺陷帶空質粒株(ΔompR-pBAD33)，ompR回補株(C-ΔompR)，ompR-pET28a-BL21重組蛋白表達菌由本實驗室制備及保存；pBAD33質粒(氯霉素抗性)、pBAD33-ompR(ompR回補質粒)；pHRP309-ssrA、pHRP309-ssrB和pHRP309-spiC分別為ssrA、ssrB和spiC基因啟動子序列與pHRP309中的lacZ基因相連。

1.1.2 主要試劑 巨噬細胞THP-1購自上海生科院細胞庫；Trizol試劑為Invitrogen公司產品; 逆轉錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒、快速DNA消化試劑盒均為TaKaRa公司產品；凝膠阻滯實驗(EMSA)上樣緩沖液為碧云天生物技術有限公司產品；β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒為Promega公司產品。

1.1.3 主要儀器 核酸紫外檢測儀(德國Eppendorf公司)；凝膠成像系統(英國SynGene公司)；ABI2720型PCR儀，高速冷凍離心機以及CO2細胞培養箱均為美國Thermo公司產品；熒光定量PCR儀，電轉化儀Gene Pulsero Ⅱ以及酶標儀均為美國Bio-Rad公司產品。

1.1.4 引物 基因特異性引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成，序列見表1(下劃線表示酶切位點)。

表1 特異性引物名稱及相應序列

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33以及C-ΔompR接種于液體LB培養基中，37℃，250 r/min培養過夜作為種子液。按1 ∶100將種子液轉接至新鮮的LB培養液中培養至對數早期[D(600 nm)約為0.4]，加入0.2%(w/v)L-阿拉伯糖繼續培養30 min以誘導ompR的表達。

1.2.2 THP-1胞內生存實驗 THP-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，在37℃、5% CO2培養箱靜置培養。細胞培養板中每孔接種5×105細胞，加入150 ng/mL佛波乙酯誘導THP-1細胞分化48 h，誘導率約為70%。實驗前1 h給細胞換上新鮮的RPMI 1640培養液。將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR菌株按“1.2.1”所述培養誘導后，按MOI=10 ∶1加入THP-1細胞培養板中培養1 h。每孔加入100 μg/mL慶大霉素后繼續培養1 h殺死胞外菌，棄上清液，PBS洗3次，將全部孔分為3等份。1/3孔內加入1 mL 0.5%(v/v)Triton X-100裂解細胞，適當稀釋后涂在LB平板，37℃過夜培養后計數平板上的菌落并乘以稀釋倍數記為T0；后2/3孔棄去1/2體積的培養液并加入等量新鮮培養液繼續分別培養12 h和24 h，然后同樣的方法計數菌落數記為T12和T24。計算并比較不同菌株的T12/T0和T24/T0(分別代表12 h和24 h細菌在巨噬細胞胞內存活能力)。實驗進行3次生物學重復。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 將WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33分別接種至液體LB培養基，培養至對數早期，離心收集菌體。Tri-zol法提取細菌總RNA，取1 μg總RNA，DNA消化試劑盒消化基因組DNA后利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。使用ssrA、ssrB和spiC特異性引物進行qRT-PCR，以16 S rRNA為內參基因，采用相對定量法分析各基因mRNA表達水平。每組設有平行樣，實驗重復3次。

1.2.4 β-半乳糖苷酶活性檢測 以S. Typhi基因組DNA為模板，利用特異性引物(序列見表1)PCR擴增目的片段，與pHRP309質粒進行雙酶切后酶連，將產物熱擊至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆提取質粒測序，序列比對完全正確后，將LacZ重組載體分別電轉至WT和ΔompR感受態細胞中，PCR驗證后，即菌株構建成功。將攜帶有LacZ重組質粒的WT和ΔompR培養至對數中期，離心棄上清, 預冷的 PBS洗滌2次后重懸。超聲儀破菌，β-半乳糖苷酶活性檢測酶聯板孔中分別加入WT和ΔompR上清液，加入30 μL檢測液后混勻，37℃靜置至溶液完全變黃，記錄反應時間，加入反應終止液混勻，利用酶標儀檢測混合液的D(415 nm)值和D(595 nm)值。實驗3次生物學重復。Miller Units的數值用來表示β-半乳糖苷酶活性，計算公式如下：Miller單位= 106×稀釋倍數×[D(415 nm)-D(595 nm)]×1.75/[體積(μL)×作用時間(min)×D(600 nm)]。

1.2.5 OmpR蛋白的表達及純化 接種ompR-pET28a-BL21重組蛋白表達菌至液體LB培養基中培養至對數期[D(600 nm)約為0.6]，加入1 mmol/L IPTG，30℃，100 r/min誘導6 h。收集菌體后超聲波破碎，離心(13 400 r/min，4℃，30 min)，收集上清，用Ni柱純化后轉入透析袋中冰上透析，用PEG2000吸去透析袋中部分水分以濃縮蛋白，測濃度后使用SDS-PAGE分析其純度，置于-80℃保存。

1.2.6 凝膠阻滯實驗 以WT基因組DNA為模板，PCR特異性擴增ssrA、ssrB和spiC基因起始密碼子上游約500 bp的啟動子區域序列并純化，16 S DNA作為陰性對照(引物見表1)。已純化的His-OmpR蛋白溶液加入含20 mmol/L新鮮乙酰磷酸鹽的結合緩沖液，室溫孵育10 min使OmpR磷酸化，結合體系配制完成后，分別加入100 ng各基因啟動子區DNA片段，30℃溫育30 min后進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙啶染色后于凝膠成像儀顯影且分析結果。

1.3 統計學分析

利用GraphPad Prism 6.0統計軟件分析數據，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OmpR對傷寒沙門菌巨噬細胞內生存力的影響

為了研究OmpR對細菌巨噬細胞內生存力的影響，使用WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR菌株進行THP-1胞內生存力實驗。結果顯示，ΔompR-pBAD33在巨噬細胞內的生存力相較于WT-pBAD33顯著降低，而C-ΔompR生存能力較ΔompR-pBAD33部分恢復(P<0.01，圖1)，說明ompR的缺失可使S. Typhi在巨噬細胞內的生存能力下降。

a: P<0.05，b: P<0.01，與同時間點WT-pBAD33比較

2.2 OmpR對巨噬細胞內生存力相關基因轉錄水平的影響

選擇與巨噬細胞內生存能力密切相關的SPI-2中3個操縱子的首基因ssrA、ssrB和spiC進行qRT-PCR分析，結果顯示，ΔompR-pBAD33中ssrA、ssrB和spiC的mRNA水平較WT-pBAD33明顯降低(P<0.01)。進一步利用β-半乳糖苷酶活性檢測實驗研究OmpR對ssrA、ssrB和spiC轉錄活性的影響，結果顯示，ΔompR中ssrA、ssrB和spiC的β-半乳糖苷酶活性比WT明顯降低(P<0.01)。見圖2。以上結果表明，OmpR正向調控ssrA、ssrB和spiC的轉錄。

a:P<0.05，b:P<0.01，與WT-pBAD33比較

圖2 qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性實驗檢測ssrA、ssrB和spiC的mRNA水平

2.3 OmpR蛋白的表達及純化

為了獲得OmpR蛋白，使用BL21表達菌株表達His-OmpR蛋白。如圖3所示，經1 mmol/L IPTG誘導后，His-OmpR蛋白的表達量較未誘導明顯增加，并且在上清液中有His-OmpR蛋白的存在，說明表達了可溶性的蛋白；經Ni柱純化后，只有單一的目的條帶，說明去除了其他非目的蛋白；進一步經濃縮后，使用相同體積的蛋白樣進行SDS-PAGE，條帶明顯加深，說明蛋白濃度明顯增加，達到了濃縮的目的。

M：蛋白分子量標準參照物

2.4 OmpR蛋白與巨噬細胞內生存力相關基因的相互作用

利用凝膠阻滯實驗檢測His-OmpR蛋白與ssrA、ssrB和spiC基因啟動子區域的相互作用。如圖4所示：His-OmpR與ssrA、ssrB和spiC的啟動子區域均有結合，且兩者的結合均呈現劑量依賴性。以上結果表明，OmpR蛋白能直接與ssrA、ssrB和spiC的啟動子區域結合來調節這些基因的表達。

16S DNA：陰性對照，1～8泳道分別加入濃度依次遞增的蛋白

圖4ssrA、ssrB和spiC的凝膠阻滯實驗

3 討論

S. Typhi是常見的腸道致病菌，可感染人體消化系統進而侵入淋巴系統引起全身癥狀[7]。S. Typhi感染人體后能夠逃避免疫系統的殺傷，在被巨噬細胞吞噬后仍然能夠存活且具有復制能力[8]。

S. Typhi在吞噬細胞內的復制是由SPI-2控制，SPI-2編碼的T3SS-2在巨噬細胞內起作用。T3SS可將效應蛋白穿過吞噬體膜輸送至宿主細胞的胞質中，對細菌在真核細胞內的存活有著重要作用[9]。目前認為，參與SPI-2基因表達調控的雙組分系統共有3套：EnvZ/OmpR、SsrA/SsrB和PhoP/PhoQ。SsrA/SsrB中的反應調節因子SsrB可激活SPI-2結構基因的表達[10]。SpiC蛋白(也稱為SsaB蛋白)是由SPI-2編碼的含127個氨基酸的蛋白質。SpiC蛋白作為T3SS2的效應蛋白，既可介導其他效應器的分泌，也能通過干擾宿主Hook3和(或)Tassc蛋白的活性，抑制含沙門氏菌的噬菌體與溶酶體和吞噬體的融合。spiC突變體無法在巨噬細胞內復制，并且對小鼠的毒力減弱[11]。OmpR調節蛋白在ssrA和ssaB的基因區域富集，說明OmpR與SPI-2之間有著復雜的聯系[12]。本文選擇SPI-2中3個操縱子的首基因ssrA、ssrB和spiC，通過qRT-PCR和β-半乳糖苷酶活性實驗發現 OmpR可促進這些基因的轉錄。進一步的EMSA實驗顯示，磷酸化的OmpR可直接與ssrA、ssrB和spiC基因啟動子區域結合。綜上所述，OmpR能夠直接調節巨噬細胞內生存力相關基因ssrA、ssrB和spiC的表達，從而增強S. Typhi在巨噬細胞內的生存能力。此研究為進一步探討OmpR的功能及相關分子調控機制奠定了基礎。