EUROPattern全自動免疫熒光核型和滴度判讀系統檢測抗核抗體的應用評價

徐紅星， 劉藝， 朱琴芳， 徐衛東

(南京醫科大學附屬蘇州市立醫院本部檢驗科， 江蘇 蘇州 215002)

抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)是自身免疫性疾病最重要的診斷指標之一[1]。抗核抗體靶抗原位于真核細胞細胞核中，但隨著人們對抗核抗體的深入研究，胞質和細胞骨架中也相繼發現[2]。目前發現有臨床意義的抗核抗體很多，如抗dsDNA抗體、抗Scl-70抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體、抗Jo-1抗體等[3]。常用抗核抗體測定方法有間接免疫熒光法(indirect immuno-fluorescence method，IIF)、免疫印跡法、酶聯免疫吸附法[4]等。其中間接免疫熒光法是抗核抗體檢測的參考方法[5-6]。

目前大部分實驗室都用間接免疫熒光法檢測抗核抗體，然后在熒光顯微鏡下用目視方法判讀，但是目視方法判讀煩瑣、效率低且人與人之間判定結果差異較大。隨著檢測標本的不斷增加，目視方法判讀已不適用于臨床。為了滿足臨床的需求，能更快、更準確地提供診斷依據，全自動熒光判讀儀應運而生，使得熒光核型判讀自動化和標準化。本研究評價EUROPattern全自動熒光判讀系統與目視方法判讀抗核抗體的結果是否有一致性和可比性，以期為臨床提供高效率、高精準性的實驗報告，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取2017年9月至2018年3月江蘇省蘇州市立醫院(本部)診斷為自身免疫性疾病且抗核抗體陽性的患者177例，男34例，女143例，年齡20～70歲，平均51歲。健康對照組選自同期體檢者25例，男6例，女19例，年齡15～80歲，平均58歲。

1.2 主要試劑與儀器

歐蒙Sprint XL全自動間接免疫熒光操作分析儀及抗核抗體IgG檢測試劑盒，EUROPattern Suit全自動熒光判讀儀，OLYMPUS熒光顯微鏡及成像系統。

1.3 檢測方法

1.3.1 間接免疫熒光法 應用Sprinter XL全自動間接免疫熒光儀進行抗核抗體的檢測，試劑盒中生物載片上包被Hep-2細胞及猴肝細胞作為基質抗原，檢測血清中抗核抗體。檢測時儀器自動將血清標本稀釋100倍，取25 μL加樣至基質片上，室溫反應30 min使血清中抗體與抗原結合，用緩沖液浸泡5 min洗去未結合抗體；加異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗人IgG抗體與抗原抗體復合物結合30 min，洗去未結合標記抗體。甘油封片，自動判讀、目視判讀抗核抗體核型和滴度。

1.3.2 全自動熒光判讀系統 EUROPattern Suit全自動熒光判讀系統由多個硬件和軟件模塊組合。使用時，打開全自動顯微鏡背部的開關，雙擊“ELO”圖標，輸入用戶名密碼登入軟件，根據日期新建一個任務，輸入或導入患者信息，點擊“Create Protocol ”創建實驗流程，按順序放好基質片，點擊“Start EPA microscope” 啟動全自動顯微鏡進行自動判讀，自動判讀完成后審核結果，將結果輸出至LIS系統。

1.4 統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行處理，采用χ2檢驗分析兩種方法檢測陽性率及方法性能評價指標間是否存在顯著性差異，用Kappa一致性檢驗分析兩種方法抗核抗體結果符合率，假設檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢測抗核抗體陽性率及方法學性能評價指標比較

以臨床診斷作為標準，比較全自動判讀系統和目視判讀方法判讀抗核抗體結果的陽性率及靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值和陰性預測值。實驗結果顯示，全自動判讀系統和目視判讀方法在自身免疫病組中的陽性檢出率分別為97.2%和98.3%，健康組中陽性檢出率分別為4.0%和0，總體的陽性檢出率分別為85.6%和86.1%，兩種判讀方法的陽性檢出率均無顯著性差異，見表1；兩種方法判讀抗核抗體結果的靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值和陰性預測值，其差異也均無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

表1 全自動判讀系統和目視判讀方法抗核抗體陽性率比較

表2 全自動判讀系統和目視判讀方法性能評價指標比較

2.2 兩種抗核抗體熒光判讀方法一致性分析

全自動判讀系統和目視判讀方法在177例自身免疫病患者中熒光核型同時陽性有169例，而25例健康對照組中同時陰性有24例，其符合率分別為95.4%和96.0%，總體符合率為95.5%，兩種方法一致性檢驗結果Kappa值為0.816(介于0.075～1.000)，見表3。

表3 全自動判讀系統和目視判讀方法抗核抗體結果符合率比較

2.3 兩種方法判讀抗核抗體所得熒光核型分布比較

以目視判讀抗核抗體熒光核型結果作為標準，將全自動判讀系統的核型判讀結果與之相比較，兩種方法總體一致率為85.1%。不同熒光模式其一致率由高到低分別為核點型(100%)、著絲點型(93.8%)、均質型(91.7%)、核仁型(88.5%)、胞質型(84.6%)、顆粒型和混合型(均80.0%)。見表4。

表4 兩種判讀方法檢測核型分布比較

2.4 兩種方法滴度判讀符合率分析

對于兩種方法核型判讀相同的標本，進一步分析其滴度判讀的符合率，結果顯示除混合型外，其余均有較高的符合率，不同熒光模式其符合率由高到低分別為核點型、核仁型、著絲點型、顆粒型、均質型、胞質型和混合型。見表5。

表5 兩種方法中相同熒光核型的滴度判讀符合率

3 討論

自身免疫性疾病因自身免疫功能紊亂而產生針對正常組織器官的病理性抗體[7]，其中抗核抗體在其診斷以及預后中有重要意義，且研究發現抗核抗體陽性可早于臨床癥狀或部分特異性抗體5年[8]。但因抗核抗體檢測方法多樣，操作人員工作條件、技術水平、結果判讀缺乏標準等各種原因，抗核抗體檢測尚不規范[9]。

本實驗結果表明，EUROPattern全自動熒光判讀系統顯示了高度準確的抗核抗體判讀結果。兩種方法在所有研究對象中陽性率分別為85.6%和86.1%，在自身免疫病患者中的陽性率達97.2%和98.3%。全自動判讀系統和目視判讀方法判讀抗核抗體結果的靈敏度、特異性、準確度均很高(均≥96%)，且都有較好的陽性預測值、陰性預測值，兩種方法間均無顯著性差異。

進一步比較兩種方法對抗核抗體熒光核型陰性和陽性結果的符合率，可見兩種檢測方法的總體符合率為95.5%，在自身免疫病患者及健康對照者中符合率分別是95.4%和96.0%，兩種方法一致性檢驗結果Kappa值為0.816。因此，全自動判讀系統陰性和陽性判讀結果可信度較高。國外已有文獻報道，全自動熒光判讀系統和傳統目視判讀方法在陰性和陽性結果的一致性可達99.4%[10-11]。

間接免疫熒光法測定抗核抗體的常見熒光模式分為3類，細胞核型：包括顆粒型、均質型、核仁型、著絲點型等；胞質型：包括胞質顆粒、線粒體、溶酶體等；有絲分裂型：紡錐體、中心體等[12]。本實驗中全自動判讀系統與目視判讀方法的核型判讀具較高一致率，其總體一致率為85.1%，不同熒光模式的一致率由高到低分別為核點型、著絲點型、核均質型、核仁型、胞質型、核顆粒型和混合型。本實驗中，核點型因例數較少而得到100%的一致率。顆粒型和混合型的一致率最低，均為80.0%。分析發現，50例目視判讀顆粒型的標本，全自動判讀系統判讀結果中顆粒型40例，混合型7例，分析其原因，可能是目視判讀方法因多種熒光模式重疊或非特異熒光的存在而導致混合型判讀為顆粒型[13]。

對于全自動熒光判讀系統和目視判讀方法核型判讀結果相同的標本，進一步分析其滴度判讀的符合率，實驗結果顯示除混合型外，其余核型均有較高的符合率，不同熒光模式其符合率由高到低分別為核點型、核仁型、著絲點型、顆粒型、均質型、胞質型和混合型。混合型本身因核型復雜而致判讀困難，故符合率較低(66.7%)。混合型滴度不一致原因主要是目視判讀滴度低于儀器判讀滴度，部分標本目視判讀陰性而儀器判讀為低滴度，以及核型判讀不一致。因此，就判讀滴度而言，儀器判讀優于目視判讀。另外還可通過對標本進行稀釋，使熒光遮蔽變得可見，從而使混合型得到準確的識別。

總體而言，全自動熒光判讀系統對抗核抗體核型和滴度判讀的結果與傳統目視判讀結果比較，顯示出較高的靈敏度、特異性及符合率。且能有效減少因主觀因素而致抗核抗體檢測結果在實驗室內、實驗室間的不一致性，提高實驗室間接免疫熒光法檢測抗核抗體的工作效率，從而實現間接免疫熒光檢測抗核抗體的自動化和標準化，更好地滿足臨床需求。