CDCP1基因重組慢病毒表達載體的構(gòu)建及其對宮頸癌細胞增殖與遷移的影響

戚曉瑜， 王青霞， 李婉， 盧春

(南京醫(yī)科大學(xué)病原微生物學(xué)系， 江蘇 南京 211166)

CUB結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(CDCP1)是一種細胞表面糖蛋白[1]，可以在造血干細胞、間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)元祖細胞中表達[2]。研究表明，CDCP1在多種癌癥細胞中高表達，包括黑色素瘤[3]、肺癌[4]、胰腺癌[5]、腎細胞癌[6]和前列腺癌[7]等。CDCP1的異常表達與細胞的存活、遷移和侵襲能力密切相關(guān)[4-5，8]，但其在宮頸癌發(fā)病過程中是否發(fā)揮作用目前并不清楚。

宮頸癌為女性子宮頸部形成的惡性腫瘤，是繼乳腺癌和結(jié)直腸癌后全球女性中第三大常見癌癥，由宮頸癌誘發(fā)的死亡病例中有86%發(fā)生在發(fā)展中國家。目前針對宮頸癌的治療方案主要包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療[9]。基因靶向治療因為效果顯著且不良反應(yīng)小等優(yōu)勢，已成為目前研究的重點，其在宮頸癌治療領(lǐng)域也具有廣泛應(yīng)用前景[10]，因此，鑒定宮頸癌發(fā)病過程中異常表達的基因在宮頸癌的預(yù)防、診斷和治療中具有重要的意義。

本研究中我們將CDCP1基因序列構(gòu)建到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen慢病毒載體上，通過慢病毒包裝系統(tǒng)獲得pHAGE-CDCP1重組慢病毒，進一步感染宮頸癌HeLa細胞，獲得穩(wěn)定高表達CDCP1的HeLa細胞系，并通過CCK-8實驗、劃痕實驗和Transwell細胞遷移實驗評估CDCP1對宮頸癌細胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質(zhì)粒 慢病毒包裝系統(tǒng)，包括包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2以及慢病毒表達載體pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen均為本實驗室保存。人胚腎上皮293 T細胞、人宮頸癌HeLa細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購于中國科學(xué)院細胞庫，均于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有10%或20%的滅活胎牛血清(美國 Gibco公司)的DMEM(美國Hyclone公司)，其中分別加入100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL氨芐西林。

1.1.2 試劑 本研究中所用PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；總RNA 提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR高保真酶(phanta酶)、質(zhì)粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒購自南京諾唯贊科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa公司；T4DNA連接酶、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Thermo Scientific公司；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α、瓊脂粉購自南京擎科生物科技有限公司；CCK-8試劑為日本Dojindo公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Flag標簽抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為南京巴傲得生物科技有限公司產(chǎn)品；Transwell小室購于Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的提取 以HUVECs的cDNA作為CDCP1 編碼序列PCR擴增的模板。首先，選取匯合度為90%的HUVECs，經(jīng)胰蛋白酶消化后，使用含有20%血清的完全DMEM終止消化，離心后棄去上清，PBS重懸洗滌后再次離心棄去上清液，根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取293 T細胞中的總RNA，之后根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得HUVECs的cDNA。

1.2.2 PCR擴增CDCP1編碼序列 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找CDCP1 編碼序列，并設(shè)計PCR引物。上游引物：5′-CGGAATTCATGGCCGGCCTGAACTGCG-GGGTCTCTATCGCACTGCTAGGGGTTCTGCTGCTGG-GT-3′(波浪線部分為保護性堿基，橫線部分為EcoR Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶識別序列)，下游引物：5′-TT-GCGGCCGCTTATTTGTCGTCGTCATCCTTGTAGTCTT-CTGCTGGCTCCATGGGCTCCTGAGTGTTTTGCGGCCGC-TTATTTGTCGTCGTCATCCTTGTAGTCTTCTGCTGGC-TCCATGGGCTCCTGAGTGTT-3′(波浪線部分為保護性堿基，橫線部分為NotⅠ限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，虛線部分為Flag標簽序列)。以HUVECs cDNA為模版，PCR擴增CDCP1 編碼序列，通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產(chǎn)物條帶在位置正確后進行切膠回收純化。

1.2.3 pHAGE-CDCP1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將上述切膠回收產(chǎn)物和pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen載體分別用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化和T4DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于含有氨芐西林的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，隨機挑選單克隆菌落于具有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～16 h，大量擴增并提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，同時進行核酸序列測定，并利用ApE軟件比對測序結(jié)果。

1.2.4 慢病毒pHAGE-CDCP1的包裝及滴度測定 將293T細胞鋪入直徑為10 cm的細胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日當細胞匯合度為70%～80%時，利用LipofectamineTM2000將包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒 pMD2.G與目的質(zhì)粒pHAGE-CDCP1共轉(zhuǎn)染入293T細胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換10%新鮮完全培養(yǎng)基，收取48～72 h的病毒液，經(jīng)0.45 μm濾器過濾，將包裝好的重組慢病毒命名為Lv-CDCP1。同時包裝對照質(zhì)粒pHAGE的病毒液，命名為Lv-Mock。采用梯度稀釋法稀釋Lv-CDCP1和對照Lv-Mock病毒液，感染293T細胞。48 h 后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達，并統(tǒng)計發(fā)出綠色熒光的細胞個數(shù)，采用以下公式計算病毒滴度： 病毒滴度(pfu/mL)=(綠色熒光細胞數(shù)/視野)×(視野數(shù)/孔數(shù))×病毒稀釋倍數(shù)÷病毒液體積。

1.2.5 重組慢病毒Lv-CDCP1感染宮頸癌HeLa細胞及免疫印跡檢測Flag標簽蛋白 將HeLa細胞鋪入6孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。第2天當細胞匯合度約50%時，用相同滴度的Lv-Mock和Lv-CDCP1慢病毒分別感染HeLa細胞，4～6 h后，將病毒液更換為10%完全培養(yǎng)基。感染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達。SDS-PAGE提取總蛋白，取100 μg樣品進行電泳并轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上；5%脫脂牛奶封閉1 h后，將PVDF膜孵育在Flag(1 ∶1 000)和α-微管蛋白(1 ∶1 000)一抗中，4℃孵育過夜；次日，TBST洗膜3次，每次5 min，用相應(yīng)二抗于37℃孵育1 h后，TBST 洗膜3次，每次5 min,于化學(xué)發(fā)光儀下顯影。

1.2.6 CCK-8實驗檢測過表達CDCP1對HeLa細胞增殖的影響 分別將 Mock-HeLa與CDCP1-HeLa以每孔2 000個細胞接種于96孔板中(每組3個重復(fù)孔)，共鋪7塊。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6及7 d后，取出一塊檢測。吸棄原培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL純DMEM和10 μL CCK-8液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育 1 h，以純DMEM調(diào)零，波長為450 nm，用全自動酶標讀數(shù)儀測出每孔D值。

1.2.7 劃痕實驗檢測過表達CDCP1對HeLa細胞遷移的影響 取Mock-HeLa和CDCP1-HeLa兩組細胞，接種于6孔板，每孔1×105個細胞，第2天長至70%～80%匯合度。用直徑為5 mm的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清的培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取樣拍照。

1.2.8 Transwell遷移實驗檢測過表達CDCP1對HeLa細胞遷移影響 取24孔板每孔加入500 μL細胞完全培養(yǎng)基，將Transwell小室置于24孔板中，小室內(nèi)接種1×104個細胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h與12 h將小室置于一個新的24孔板中，浸泡于甲醇中固定15 min，再用結(jié)晶紫染色15 min。用棉簽攪去小室內(nèi)部底部多余細胞，將小室倒置晾干后，于顯微鏡下拍攝小室上、下、左、右、中5個視野，進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行，各組間差異比較采用兩樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗結(jié)果均獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pHAGE-CDCP1的構(gòu)建與鑒定

通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得CDCP1 編碼序列，根據(jù)該序列設(shè)計擴增引物，以HUVECs的cDNA為模板進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增片段約2 549 bp且條帶單一，與預(yù)期相符(圖1A)。以EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pHAGE-CDCP1，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，在7 742 bp和2 549 bp處有明顯條帶(圖1B)，分別為慢病毒載體 pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen和CDCP1基因。對重組質(zhì)粒pHAGE-CDCP1進行核酸序列測定，經(jīng)ApE軟件比對，插入的CDCP1基因片段與理論序列一致(圖1C)，表明 pHAGE-CDCP1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組慢病毒Lv-CDCP1的包裝及感染

利用LipofectamineTM2000將包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒與目的質(zhì)粒pHAGE-CDCP1共轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得重組慢病毒Lv-CDCP1及其對照病毒Lv-Mock。采用梯度稀釋法測定病毒滴度后，以相同病毒滴度分別感染宮頸癌細胞HeLa。48 h后觀察到約95%細胞表達GFP，且細胞狀態(tài)良好(圖2A)。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果表明，過表達CDCP1的宮頸癌HeLa細胞構(gòu)建成功(圖2B)。

A：CDCP1基因的擴增；B：重組質(zhì)粒pHAGE-CDCP1的雙酶切鑒定；C：重組質(zhì)粒測序結(jié)果

A：Lv-Mock和Lv-CDCP1分別感染HeLa細胞后GFP的表達(×200)；B：蛋白印跡檢測重組慢病毒CDCP1感染HeLa細胞后相關(guān)蛋白的表達

2.3 CCK-8實驗檢測過表達CDCP1基因?qū)m頸癌HeLa細胞增殖的影響

實驗結(jié)果顯示，從第4天起，CDCP1-HeLa組細胞在450 nm處D值明顯高于Mock-HeLa組(P<0.05或P<0.01)，見圖3。提示宮頸癌HeLa細胞中過表達CDCP1可以促進細胞的增殖。

2.4 劃痕實驗檢測重組慢病毒CDCP1感染對HeLa細胞遷移能力的影響

采用劃痕實驗法評價過表達CDCP1對HeLa細胞遷移的影響。結(jié)果顯示，第24小時，感染CDCP1病毒液組的HeLa細胞的遷移能力顯著高于對照病毒液感染組(P<0.01),見圖4。結(jié)果提示，過表達CDCP1能夠促進HeLa細胞的遷移。

a: P<0.05, b: P<0.01,與Mock-HeLa細胞比較

2.5 Transwell遷移實驗檢測過表達CDCP1對HeLa細胞的遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，過表達CDCP1組的HeLa細胞，6 h和12 h遷移數(shù)量明顯多于對照組(P<0.05或P<0.01),見圖5。該結(jié)果表明CDCP1表達水平的提高可以增強HeLa細胞的遷移能力。

圖4 劃痕實驗法檢測過表達CDCP1對HeLa細胞遷移的影響(×200)

圖5 Transwell遷移實驗檢測過表達CDCP1對HeLa細胞遷移的影響

3 討論

作為女性第三大常發(fā)癌癥，宮頸癌仍然是重要的全球性公共衛(wèi)生問題[10]。大多數(shù)發(fā)展中國家婦女確診宮頸癌時已是晚期，通常無法治療或僅可進行姑息治療，5年生存率很低[9]。因此，深入研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制，尋找差異表達的基因，可為宮頸癌診斷提供新的生物標志物，為其治療提供特異性靶點。

CDCP1是包含836個氨基酸的蛋白質(zhì)，由29個殘基的氨基末端信號肽、細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和含有150個氨基酸的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[11]。已有研究表明[12]，表達異常的CDCP1與多種癌癥有關(guān)，其在腎癌、肺腺癌中的異常表達與疾病進展指標(腫瘤分期，組織學(xué)分級和轉(zhuǎn)移等)顯著相關(guān)。CDCP1高表達可促進腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，CDCP1高表達患者總體生存率明顯降低。

本研究中，我們通過分子克隆技術(shù)獲得pHAGE-CDCP1重組質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝系統(tǒng)獲取Lv-CDCP1重組慢病毒并感染宮頸癌HeLa細胞，構(gòu)建了穩(wěn)定過表達CDCP1的HeLa細胞系。進一步功能學(xué)CCK-8結(jié)果表明，CDCP1可以促進宮頸癌HeLa細胞的增殖，細胞劃痕實驗和細胞遷移實驗結(jié)果均顯示，CDCP1可以促進宮頸癌HeLa細胞的遷移能力，提示CDCP1在宮頸癌中可能是促癌基因。本研究為后續(xù)進一步研究CDCP1在宮頸癌等相關(guān)腫瘤發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)，有望為探索和治療宮頸癌發(fā)生機制提供潛在的藥物靶點。