非小細胞肺癌患者血漿中lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB的表達及診斷價值

呂夢佳， 李堅， 陳萍， 王寧新， 汪毅

(江蘇大學附屬醫院1. 呼吸科， 2. 中心實驗室， 江蘇 鎮江 212001)

早期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)通過手術切除可獲得較好預后，但大部分患者確診時已處于晚期，總體5年生存率只有15%左右[1-2]。雖然臨床上已有一些用于NSCLC診斷的標志物，如癌胚抗原、細胞角蛋白十九片段(Cyfra21-1)等，但其敏感性及特異性較低[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其調控基因表達，與腫瘤細胞的發生密切相關[4-5]。lncRNAs在多種類型腫瘤的不同階段呈特異性表達，與腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移顯著相關[6-8]。研究發現，lncRNA為多種腫瘤早期診斷的標志物，如肝癌、胃癌和前列腺癌等[9-11]。lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA-MALAT1)是最早報道與肺癌有關的lncRNA[6]，在多種腫瘤如乳腺癌、胰腺癌和NSCLC中表達上調，且促進NSCLC發生遠處轉移[12-13]。與lncRNA-MALAT1相似，轉化生長因子β激活的lncRNA(lncRNA activated by TGF-β，lncRNA-ATB)在NSCLC腫瘤組織中呈高表達，常提示預后不良[14-15]。lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB均可在外周血中測出[2, 16]，但是，NSCLC患者血漿中二者的表達及聯合診斷NSCLC的效能尚不清楚。本研究擬通過測定并分析NSCLC患者和良性肺病患者血漿lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB的表達水平，探討其在NSCLC診斷中的臨床價值。

1 病例與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2018年10月于江蘇大學附屬醫院呼吸內科初診為NSCLC的患者60例(NSCLC組)，納入標準：均經病理組織學或細胞學檢查最終確診為NSCLC；未接受手術、放療、化療、分子靶向治療及免疫治療等一切干預措施；除外轉移性肺癌。其中，男37例，女23例；年齡41～85歲，平均67.6歲；肺腺癌39例，肺鱗癌21例；根據2017年國際抗癌聯盟(UICC)肺癌TNM分期(第8版)，Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期56例。同時選取同期住院的良性肺病患者60例作為對照(良性肺病組)，其中，男46例，女14例；年齡25～81歲，平均66.4歲；肺炎22例，慢性阻塞性肺病18例，支氣管擴張7例，肺結核4例，肺膿腫、結節病、間質性肺病、支氣管哮喘各2例，肺囊腫1例。最后選取20例健康志愿者的血漿用于熒光定量PCR測定lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB的校對樣本。本研究經江蘇大學附屬醫院醫學倫理委員會審查并批準，受試者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

SL 16R水平冷凍離心機及MICRO 21R高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；Trizol?試劑(美國英杰公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒及TB GreenTMPremixExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(大連寶生物公司)；Mycycler PCR儀及CFX96實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 血漿標本的采集

采集受試者空腹外周靜脈血4 mL于EDTA抗凝管，在1 h內完成以下步驟：3 000 r/min，4 ℃離心10 min，轉移上清液至新EP管中；12 000×g，4℃離心10 min，分裝血漿(600 μL/管)，存于-80 ℃備用。另外用促凝管收集受試者空腹外周靜脈血2 mL送至本院核醫學科檢測血清癌胚抗原及Cyfra21-1水平。正常值參考范圍：癌胚抗原為0～5 ng/mL，Cyfra21-1為0.21～7 ng/mL。

1.4 血漿RNA及cDNA的提取

取凍存血漿標本600 μL，室溫解凍，根據Trizol試劑說明書提取總RNA。取RNA溶解液13 μL，根據大連寶生物公司試劑盒(型號RR036)說明書行逆轉錄反應：37 ℃ 15 min(逆轉錄)，85 ℃ 5 s(逆轉錄酶失活)，4 ℃得到cDNA，存于-20 ℃備用。

1.5 熒光定量PCR法檢測血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB相對表達量

采用Primer Premier 5.0軟件設計GAPDH、lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB引物，并由上海生工公司合成。GAPDH上游引物：5′-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，下游引物：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′；lncRNA-MALAT1上游引物：5′-GCTGGAGTAACTGGCATGTGAG-3′，下游引物：5′-GGCTGACACTTCTCTTGACCTTAG-3′；lncRNA-ATB上游引物：5′-TCTCAGAAGCTCACCAAGGTCCTC-3′，下游引物：5′-CCAGTCCTGGCAGCATTCATCATC-3′。以cDNA為模板，GAPDH為內參，用試劑盒行PCR反應：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火，延伸 5 s，共40個循環。每個樣本設3個復孔，根據溶解曲線形態判斷反應產物的特異性，采用2-△△Ct法計算血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB的相對表達水平。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 血漿中lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB的表達水平

與良性肺病組相比，NSCLC組血漿lncRNA-MALAT1表達水平明顯降低(t=2.764，P=0.007)，血漿lncRNA-ATB表達水平明顯增高(t=-2.348，P=0.021)。見圖1。

圖1 lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB在兩組患者血漿中的表達水平比較

2.2 血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB的表達水平與NSCLC臨床病理特征的關系

由表1可見，血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB表達水平與NSCLC患者性別、年齡、吸煙指數、組織病理類型及TNM分期等臨床病理特征無顯著相關(P均>0.05)。

2.3 血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB診斷NSCLC的ROC曲線

血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB診斷NSCLC的AUC均高于血清癌胚抗原和Cyfra21-1。lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB聯合檢測診斷NSCLC的AUC為0.853(95%CI0.784～0.923)，高于二者單獨檢測(圖2)。

根據ROC曲線設定診斷NSCLC的截斷值，血漿lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB分別為0.483和0.533，二者聯合為0.634，血清癌胚抗原和Cyfra21-1分別為0.384和0.366。血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB診斷NSCLC的準確性均較血清癌胚抗原及Cyfra21-1高，但是二者敏感性低于癌胚抗原，特異性低于Cyfra21-1。另外，lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB聯合檢測診斷NSCLC的敏感性、特異性及準確性均較單項檢測高(表2)。

表1 NSCLC患者血漿lncRNA-MALAT1和lncRNA-ATB表達水平與臨床病理特征的關系

圖2 不同檢測指標診斷NSCLC的ROC曲線

表2 4種腫瘤標志物檢測對NSCLC的診斷效果

3 討論

研究顯示，lncRNA-MALAT1在NSCLC組織及細胞系中表達上調[1, 17]，早期NSCLC患者手術切除標本腫瘤組織中lncRNA-MALAT1高表達可預測腫瘤轉移和不良預后[1]，肺鱗癌組織中lncRNA-MALAT1高表達患者生存期明顯短于低表達患者[17]，提示lncRNA-MALAT1對NSCLC起促癌作用。有研究認為，腫瘤患者血液lncRNAs來源于癌組織釋放入血液中的外泌體[18-19]，因此其在血液中的表達與原發腫瘤組織相平行。本研究結果顯示，與良性肺病患者相比，NSCLC患者血漿lncRNA-MALAT1表達水平明顯降低。分析原因可能是不同研究間入組NSCLC患者癌組織學類型存在差異、腫瘤異質性以及患者血液的免疫狀態不同等[20-21]。

研究顯示，已發生遠處轉移的NSCLC患者腫瘤組織lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB表達水平明顯高于未發生轉移患者[15, 17]，提示lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB表達上調反映NSCLC患者的腫瘤分期偏晚。本研究結果顯示，血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB表達水平與NSCLC患者TNM分期無明顯相關性，可能是本研究入組NSCLC患者大多已處于腫瘤晚期，使樣本分布不均。

Weber等[13]及徐丹等[16]研究顯示，血液lncRNA-MALAT1診斷NSCLC的敏感性和特異性分別為56%和96%，血清lncRNA-ATB敏感性及特異性分別為72.4 %和79.5%。本研究顯示血漿lncRNA-MALAT1診斷NSCLC的敏感性和特異性分別為78.3%和70.0%，血漿lncRNA-ATB敏感性和特異性分別為78.3%和75.0%。

綜上所述，血漿lncRNA-MALAT1及lncRNA-ATB對于NSCLC診斷具有一定的臨床價值，二者聯合檢測可提高診斷NSCLC的敏感性、特異性及準確性。