基于肝臟微結構的豬肝祛毒方法的建立和祛毒豬肝食品的初步研發

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(1 山東省數字醫學與計算機輔助手術重點實驗室，青島大學附屬醫院，山東 青島 266003；2 山東省數字醫學臨床診療與營養健康協同創新中心；3 青島大學附屬醫院小兒外科；4 青島大學附屬醫院手術室；5 青島大學公共衛生學院；6 青島大學附屬醫院內分泌科;7 青島萬福集團股份有限公司)

肝臟是機體儲存營養物質的重要器官。豬肝富含維生素A、蛋白質及鐵、鋅、硒等礦物質，是兒童、孕婦、老年人、貧血人群、呼吸道感染患者等特殊人群補充營養的必備食品[1]，可為提升人體免疫力提供重要物質保障[2]，也常被營養學家推薦食用[3]。然而，肝臟也是機體重要的解毒器官，許多學者在肯定豬肝營養價值的同時，也表示了對豬肝殘留毒素的憂心[4-6]。營養學家建議豬肝在烹調前必須徹底清洗干凈[6-7]。

從肝臟正常代謝和肝臟微結構形態來看，動物肝臟中內毒素及病原菌的含量遠比肌肉高[8-9]。肝臟“解毒”主要是依靠肝臟內的枯否細胞(Kupffer細胞)和其他免疫細胞吞噬肝臟中的內毒素和病原菌[10-11]，這些“吞噬”毒素的枯否細胞和其他免疫細胞主要聚集在肝臟內肝血竇中的血液中[12]，如不將肝血竇中的血液清除干凈，就無法實現豬肝最大程度“祛毒”。據文獻報道，豬肝祛毒常用的方法有整體浸泡法和切片清洗法[6]。雖然，上述方法有一定的祛毒作用，但肝臟離體后，部分血液會快速凝固在微小的肝血竇中，無法實現徹底清除，因此并不能最大程度地祛除毒素。

肝臟灌注是活體肝移植手術中較常用的肝臟保存方法[13-14]，然而能否利用肝臟灌注實現生鮮豬肝祛毒，目前尚未見相關報道。本研究利用肝臟灌注技術進行豬肝祛毒，通過肝臟超微結構三維重建圖像來評價祛毒效果，利用感官品質評分方法評價灌注祛毒方法對豬肝性狀和口感的影響，最后利用祛毒豬肝初步開發相關產品。

1 材料與方法

1.1 主要材料

新鮮豬肝由青島萬福集團股份有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

灌注液為含有1 g/L檸檬酸鈉的生理鹽水；蘇木精-伊紅(HE)染色液(北京九州柏林生物有限公司)；自制流量可控灌注泵、灌注臺、灌注管和灌注頭各一套；全自動脫水機ASP300S(Leica，德國)；切片掃描顯微鏡(Nikon，日本)。

1.3 新鮮豬肝祛毒方法

所有豬肝灌注祛毒過程均在青島萬福集團股份有限公司豬屠宰產線旁進行。豬肝在離體后1 min內實施灌注處理。取表面被膜完整的生鮮豬肝平鋪于灌注臺上，立即將灌注液通過門靜脈和肝動脈血管灌注，直至肝靜脈流出的灌注液清澈、肝臟表面呈黃白色無花斑為止。灌注在亞低溫(20 ℃)條件下進行，灌注流量設置為280 mL/s。豬肝灌注完成后，切除膽囊，置于4 ℃控水過夜待用[15]。傳統浸泡法祛毒豬肝按文獻方法制備[6]。

1.4 豬肝微結構三維重建和祛毒效果評價方法

1.4.1豬肝微結構圖像采集 取灌注清洗后距離肝臟表面0.5 cm的肝實質，切成約1 cm3小塊，放置于4%多聚甲醛液中固定(過夜)，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4m厚切片。在40 ℃溫水中展片、撈片后烘干，HE染色，常規脫水、透明、封片后晾干。最后用切片掃描顯微鏡收集圖像數據。

1.4.2豬肝微結構三維重建 先將所有圖像利用基于B樣條的形變配準方法進行配準。將配準后圖片輸入VTK三維重建工具包進行重建，重建后對圖像進行著色和渲染，模型建立后保存。

1.4.3豬肝祛毒效果評價 利用豬肝微結構二維顯微圖像和三維圖像，觀察豬肝肝細胞形態和豬肝肝小葉內所有微血管、肝血竇等微結構的潔凈程度，來判斷灌注祛毒方法的有效性。

1.5 祛毒豬肝食品加工制作方法

1.5.1鹵豬肝制備方法 取經傳統浸泡法祛毒處理生鮮豬肝和經灌注祛毒處理生鮮豬肝各2個，分別在兩個蒸汽夾層鍋中同時加料鹵制至全熟，撈出晾涼，去除大血管，用切片機將豬肝1 cm厚切片，將長寬均小于5 cm的豬肝小塊裝袋，每袋3～5片，高溫高壓殺菌備用。

1.5.2無淀粉豬肝火腿(簡稱豬肝火腿)和維也納豬肝香腸(簡稱豬肝香腸)制備方法 取豬肉和雞肉按質量分數為0.65∶0.35制作豬肝火腿和豬肝香腸的配料，取經灌注處理生鮮豬肝，制作3種不同豬肝含量的餡料作為3個實驗組，即豬肝和配料質量分數分別為0.15∶0.85(A組)、0.25∶0.75(B組)和0.35∶0.65(C組)來制作最終的灌裝用餡料。餡料加調味料斬拌后，進行灌裝-蒸煮-封裝-滅菌處理。在研發初期，豬肝火腿和豬肝火腿及香腸灌裝餡料相同，豬肝火腿使用纖維素腸衣，每根350 g，豬肝香腸使用羊腸腸衣，每根50 g。

1.6 祛毒豬肝產品感官品質評價方法

新冠肺炎疫情期間，豬肝火腿和豬肝香腸產品被送至武漢，為前線醫護人員提供一定的膳食營養保障，同時設計簡單問卷調查，對131名武漢新冠肺炎抗疫醫護人員和307名普通人群進行了問卷，初步評判豬肝火腿和豬肝香腸產品的大眾接受度。產品問卷以微信小程序形式推送，所有問題為單選。具體評分內容和標準見表1～3。

表1 鹵豬肝感官品質評價標準

表2 豬肝火腿及香腸感官品質評價標準

表3 祛毒豬肝產品接受度調查問卷

2 結 果

2.1 豬肝肝小葉微結構三維重建結果

通過對灌注清洗豬肝肝小葉的三維圖像重建，觀察發現豬肝肝小葉的形態呈典型的多面棱柱狀(圖1A)，內部微型管路清晰可見，被測豬肝肝小葉直徑約1.5 mm。肝小葉三維重建模型可以任意角度旋轉觀察肝細胞狀態以及微小血管管路、肝板、肝血竇等微結構的情況(圖1B、C，視頻1)。

2.2 豬肝祛毒效果評價

與未處理豬肝(圖2A)相比，經灌注祛毒后的豬肝呈黃白色(圖2B)，兩者有明顯差別。經灌注祛毒后，豬肝質量增加約0.5 kg，經4 h控水后，豬肝質量減輕至初始值。

經豬肝組織切片觀察，浸泡祛毒的豬肝肝血竇內仍然存在大量的血細胞和含有內毒素的巨噬細胞等雜質(圖3A)；豬肝經過灌注祛毒后，肝竇內部未見血細胞和其他雜質(圖3B、C)，經高倍顯微鏡圖像(圖3C)和三維重建圖像(圖3D)觀察豬肝細胞形態良好，高灌注壓和亞低溫灌注對豬肝細胞無影響，且灌注祛毒豬肝肝小葉內部微血管等微結構內部也未見血細胞和巨噬細胞等雜質。

A：肝小葉三維立體圖；B：肝小葉表面局部放大圖；C：肝小葉血管局部放大圖像

A：未祛毒豬肝；B：灌注祛毒豬肝

2.3 豬肝灌注祛毒對豬肝性狀、口感等的影響

A組色澤、軟硬度、腥味以及苦味平均得分顯著低于B組(t=4.97～22.87，P<0.01)；B組的綜合評分顯著高于A組(t=25.89，P<0.01)。見表4。

2.4 豬肝火腿和豬肝香腸的感官品質評價結果

A、B以及C組綜合評分分別為(73.47±1.67)、(77.33±2.63)、(56.60±2.63)分，3組比較差異有顯著性(F=46.35，P<0.01)；B組綜合評分與A組比較差異無顯著性(P>0.05)；A、B組綜合評分與C組比較差異有顯著性(P<0.01)。

A：10倍物鏡觀察下浸泡祛毒豬肝組織切片；B：10倍物鏡觀察下灌注祛毒豬肝組織切片；C：40倍物鏡觀察下灌注祛毒法豬肝組織切片；D：豬肝肝小葉血管內壁細胞立體結構
圖3 豬肝微結構的二維和三維圖像

表4 兩種鹵制豬肝各項指標以及綜合評分結果比較(n=30，分，

2.5 祛毒豬肝火腿和豬肝香腸產品初步調查問卷結果

對豬肝質量分數為0.25的豬肝火腿和豬肝香腸產品進行了問卷，97%醫護人員和普通人群認為兩款豬肝產品口感好；61%的人認為豬肝香腸口感更好；67%的人認為可以嘗到豬肝的香味；83%的人認為兩款豬肝產品沒有腥味，16%的人認為兩款豬肝產品有一點腥味，1%的人認為兩款豬肝產品腥味大；91%的人認為兩款豬肝產品沒有苦味，9%的人認為有一點苦味。

3 討 論

本研究通過對豬肝超微結構二維和三維重建圖像觀察，證明豬肝灌注清洗方法可以有效地清除肝血竇內的血液，從而有效地祛除肝竇血液內含有毒素的枯否細胞和其他免疫細胞。不同于傳統肝臟三維重建方法[16-17]，本研究采用的微結構三維重建算法能夠立體、多角度展現肝臟微小結構，從而可以直觀地評價豬肝祛毒效果。

與臨床中器官移植肝臟灌注方法[14]相比，本研究對生鮮豬肝灌注的目的是在不破壞肝細胞形態的前提下祛除肝臟內毒素，不考慮肝細胞的活性及各類酶的水平，因此選用的灌注液成分較為簡單。另外，本研究中使用的灌注流量是臨床肝臟灌注流量的28倍[18]，高流量沖洗能夠快速清除豬肝細胞間隙內殘存的血液等雜質，組織學分析結果證實高流量灌注沒有破壞豬肝細胞的形態結構，這為祛毒豬肝批量生產提供了充分的實驗依據。

豬肝富含維生素A。研究表明維生素A對保護和修復呼吸道黏膜組織具有非常重要的作用[19]。當體內維生素A水平下降時，鼻、咽、喉和其他呼吸道黏膜角質化，導致機體易被細菌侵襲和感染，特別是嬰幼兒，可由此引發支氣管肺炎，嚴重者會導致呼吸衰竭死亡[20-21]。另外，豬肝內還含有豐富的優質蛋白質、B族維生素及鐵、鋅、硒等營養元素，對提高人體免疫力也有非常重要的作用[2]。新冠肺炎疫情期間，在膳食中適當增加豬肝的攝入，對抗擊疫情具有一定的輔助作用。本研究制作的豬肝質量分數為0.25的豬肝火腿和豬肝香腸被送往武漢，為醫護人員補充膳食營養，得到醫護人員的一致好評。

本研究感官評價結果表明，經灌注祛毒的豬肝色澤和口感都有極為顯著的改善，為豬肝食品的研發奠定了實驗基礎。問卷調查顯示，醫護人員與普通人群對兩款祛毒豬肝產品評價良好，從數據來看兩款豬肝產品不論口味還是產品形式，都得到被調查人員一定程度的認可，這為祛毒豬肝產品產業化奠定了實驗基礎。本文采用的生鮮動物肝臟祛毒技術，以及基于祛毒動物肝臟的食品加工方法、嬰幼兒輔食食品加工方法以及老年人保健食品加工方法等內容已獲得4項中國及2項國際專利保護[15,22-26]，這對產品擴展研發和向國內外市場轉化都有非常重要的意義。本研究是祛毒豬肝技術和相關產品研發的初步實驗研究，今后將重點對祛毒豬肝含有營養素的情況，以及基于祛毒豬肝的嬰幼兒輔食、老年人干粉等產品展開深入的研究。

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視頻1 豬肝肝小葉微結構三維重建視頻