蠟狀芽孢桿菌協同李氏禾根系分泌物去除水體Cr6+的效應及機制

林華，林志毅，滿向甜，Kong-CHHUON，劉杰，俞果*

1. 桂林理工大學/廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，廣西 桂林 541004；2. 桂林理工大學巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，廣西 桂林 541004；3. 柬埔寨理工學院，柬埔寨 金邊 120000

根系分泌物是植物生長過程中分泌并釋放到根際環境中的有機化合物的總稱，目前已知的根系分泌物種類有200種左右，包括氨基酸、有機酸、酶、可溶性糖等（Boeuf-Tremblay et al.，1994；Baetz et al.，2014）。這些根系分泌物是植物與土壤環境進行物質和能量交換的載體，對根際土壤的理化性質有重要的影響（Haichar et al.，2014；Bertin et al.，2003）。近年來，隨著高效液相色譜、氣相色譜等分析技術的研發和應用，世界各國科研人員在環境污染防治、土壤學等領域對根系分泌物開展了廣泛的研究。研究表明，根系分泌物可以改善土壤質量、提高植物抗性，在土壤修復尤其是在土壤重金屬污染的植物修復領域發揮著巨大的作用。王艷紅等（2008）發現鋅（Zn）超富集植物東南景天（Sedum alfrediiHance）的根系分泌物能活化土壤中難溶態的 ZnO、ZnCO3等。盧豪良等（2007）發現秋茄（Kandelia candelL.）的根系分泌物能有效提高沉積物中重金屬（Cu、Pb、Cd、Zn）的生物有效性。

鉻（Cr）是一種危害性大的環境污染物，其對生物體具有明顯的致癌和致畸作用，因此鉻污染被世界各國列為重點防治對象（Miretzky et al.，2010；Wise et al.，2014）。李氏禾（Leersia hexandraSwartz）是中國首次發現和唯一報道的濕生鉻超富集植物，對Cr6+具有很強的吸收和富集能力，在鉻污染水體的植物修復方面表現出巨大的潛力（Zhang et al.，2007）。近幾年來，關于李氏禾超富集鉻的研究取得了不少進展，但是還有一些問題仍需深入研究：如李氏禾如何通過根系分泌作用適應鉻脅迫，其根系分泌物與根際微生物的協同作用等（Liu et al.，2009；Liu et al.，2011；Zhang et al.，2009）。伍嬋翠等（2016）發現李氏禾根系分泌物對土壤中難溶性鉻具有較強的活化作用。我們的前期實驗結果表明，李氏禾根際存在較高豐度的蠟狀芽孢桿菌，而蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種耐高濃度鉻脅迫的微生物，這意味著在李氏禾耐受和富集Cr6+的過程中蠟狀芽孢桿菌可能起到了重要的作用。

本研究在水培條件下，研究添加外源蠟狀芽孢桿菌與李氏禾的根系分泌物共同凈化水體Cr6+的影響，并利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）研究Cr6+脅迫和添加外源蠟狀芽孢桿菌對李氏禾根系分泌物組成成分的影響，以明確根系分泌物在李氏禾還原Cr6+過程中的作用，進一步豐富李氏禾超富集鉻的生理機制，為提高李氏禾修復Cr6+污染水體效率提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試李氏禾采自于廣西桂林市雁山鎮周邊未受重金屬污染的田埂間，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）購自中國典型培養物菌種保藏中心（菌種編號CCTCCAB2011085），菌株接種于液體培養基中擴大培養12 h后，4000 r·min-1離心10 min，棄上清液，離心后的菌體添加適量無菌水調節菌體濃度為108cfu·mL-1的菌懸浮液備用。

1.2 植物的預培養

選取生長一致的李氏禾幼苗，用去離子水洗凈，分別栽入含有1.5 L體積分數為50%的Hoagland營養液的塑料盆中，塑料盆容積為 2 L，在人工氣候室中預培養7 d，每3 d更換一次營養液。人工氣候室培養條件設置：光照16 h，溫度25 ℃，光照強度7000 Lx，相對濕度75%。

1.3 根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌相互作用對 Cr6+還原實驗設計

為保證實驗過程中根系分泌物成分不變，取預培養中李氏禾的原水培液100 mL，置于250 mL錐形瓶中進行實驗，向每一組的錐形瓶中添加適量Cr6+（K2Cr2O7）溶液使初始質量濃度為 10 mg·L-1。以不添加蠟狀芽孢桿菌和李氏禾根系分泌物作為空白組，另外四組實驗處理分別添加：活菌、根系分泌物、根系分泌物+活菌、根系分泌物+滅活菌。實驗使用的活菌為 1.1中制備的 108cfu·mL-1蠟狀芽胞桿菌懸浮液；滅活菌采用擴大培養后的蠟狀芽胞桿菌經高壓蒸汽120 ℃，滅活20 min；將錐形瓶放入恒溫搖床振蕩培養，培養條件為 30 ℃、160 rmp，每隔2 h對錐形瓶中溶液進行取樣，測定溶液中Cr6+含量，測試方法為二苯碳酰二肼分光光度法（賴永忠，2019）。對于含有蠟狀芽胞桿菌的3個處理組（活菌、根系分泌物+活菌、根系分泌物+滅活菌），同時測細菌溶液在波長600 nm處的吸光度，利用細菌的吸光值來反應細菌菌體細胞密度，從而了解細菌的生長情況，繪制細菌生長曲線。

1.4 根系分泌物的收集實驗設計和分析測定方法

取預培養好之后生長一致的李氏禾幼苗，用去離子水反復清洗，分別移植20—30株李氏禾到備好的塑料盆中，塑料盆中的李氏禾設置3組處理：（1）用質量濃度10 mg·L-1Cr6+（K2Cr2O7）溶液脅迫李氏禾；（2）在 10 mg·L-1Cr6+（K2Cr2O7）鉻脅迫下向培養液加入一定量 108cfu·mL-1的蠟狀芽孢桿菌懸浮液；（3）只用去離子水培養李氏禾作為對照組（即培養的李氏禾不加鉻）。使用通氣泵每天給李氏禾的培養液中通氣3 h（早中晚各1 h），培養10 d后收集李氏禾根系分泌物，操作如下：將培養10 d的李氏禾取出并用去離子水反復沖洗，在新制備的超純水中加入 3滴體積分數 0.05%的百里酚溶液，浸泡李氏禾根部 5 min。然后將李氏禾放入 0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液中，放置于光照培養箱中培養24 h，之后收集含有根系分泌物的溶液，過0.45 μm濾膜，用真空旋轉蒸發儀（40 ℃，90 r·min-1）濃縮至20 mL冷凍干燥，用去離子水定容至2 mL，轉移至GC進樣小瓶，在4 ℃冰箱冷藏，供GC-MS分析。

GC測試條件：美國 PerkinElmer氣相色譜-質譜聯用儀（Claus 680 GC；600T MS）；Elite-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；色譜柱升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升溫至250 ℃并保持15 min；進樣口溫度；載氣：純度為99.999%的氦氣，載氣流速1 mL·min-1；進樣方式：分流進樣，進樣量l μL。

MS分析條件：EI離子源，電離電壓70 eV；質譜掃描方式：全掃描，掃描范圍為50—800 amu；離子源溫度200 ℃；接口溫度25 ℃；檢測電壓1 kv；溶劑延遲時間3 min。

1.5 數據處理

本研究采用Excel 2010、Origin 8.5和SPSS 18.0進行統計分析和作圖。

2 結果與討論

2.1 李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌聯合作用下凈化水中Cr6+的效果

圖1 不同外源條件對水中Cr6+還原率的影響Fig. 1 Effect of different exogenous conditions on the reduction rate of Cr6+ in the water

圖2 根系分泌物對蠟狀芽胞桿菌生長量的影響Fig. 2 Effect of root exudates on the growth of Bacillus cereus

由圖1可知，隨著培養時間的延長，溶液中Cr6+的還原率也逐漸升高，最終趨于穩定。對比空白組，李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌活菌聯合作用對Cr6+的還原效果最為明顯（P＜0.05），在第10小時還原率達到75%，在24 h時還原率高達99%。李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌滅活菌聯合作用下，前8 h溶液中Cr6+的還原率穩定在20%作用，在第 8小時時 Cr6+還原率增加到 60%，并在第22小時趨于穩定，達到88%。蠟狀芽孢桿菌活菌單獨作用對溶液中 Cr6+的還原作用明顯低于前兩組（P＜0.05），還原率在第 22小時時達到 58%并趨于穩定。李氏禾根系分泌物處理組中Cr6+的還原率穩定在23%左右，顯著高于空白組（P＜0.05）。實驗結果表明，加入適量濃度的蠟狀芽孢桿菌菌液，與李氏禾根系分泌物共同作用，使溶液中Cr6+的還原率明顯增加。此外，高溫蒸汽滅活可能不能完全殺死菌液中的蠟狀芽孢桿菌，導致李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌滅活菌聯合處理組經過一段時間后對Cr6+還原率也基本達到了李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌活菌聯合處理組的水平。李氏禾根系分泌物能為蠟狀芽孢桿菌提供必要的營養條件，增強其代謝能力，促進了蠟狀芽孢桿菌對水體中的Cr6+的還原，可以通過對根系分泌物對的成分分析進一步驗證。前人研究表明，蠟狀芽孢桿菌不但能夠依靠自身的胞外分泌物還原Cr6+，其細胞壁也可以還原Cr6+，并固定在自身表面（Chen et al.，2012）。同時，植物根系分泌物中的烯烴、酸、醇、酚、醛也能夠還原Cr6+（林琦等，2003）。實驗結果表明，充分發揮李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌還原Cr6+的協同效應，是提高 Cr6+污染水體植物修復效率的關鍵。

由圖2可知，前4 h蠟狀芽孢桿菌的光密度值都呈線性增長，添加李氏禾根系分泌物溶液中的蠟狀芽孢桿菌生長情況良好，光密度值穩定在1.5左右，顯著高于單獨蠟狀芽孢桿菌處理組（P＜0.05），說明添加李氏禾根系分泌物對于蠟狀芽孢桿菌的生長具有促進作用。添加李氏禾根系分泌物溶液的蠟狀芽孢桿菌滅活菌處理組光密度值同樣不斷增長，且在第 16小時超過其他處理組，最終穩定在2.0左右。這進一步說明蠟狀芽孢桿菌在高溫高壓蒸汽的過程中并未完全失活。研究表明，根系分泌物中的氨基酸、烷烴等物質能為微生物提供重要的碳源、能源物質，使植物根際的微生物數量遠遠超過非根際，同時微生物又能促進根系的分泌作用（羅繼鵬等，2018；吳林坤等，2014）。

2.2 李氏禾根系分泌物 GC-MS掃描圖譜及結果分析

本文列出了在無鉻、10 mg·L-1Cr6+脅迫、10 mg·L-1Cr6+脅迫條件下接種蠟狀芽孢桿菌李氏禾根系分泌物的GC-MS掃描圖譜。圖3—5結果顯示，李氏禾根系分泌物樣品檢測出的圖譜特征峰比較顯著，分布較密集，基線漂移不大，故檢測結果比較可信。3種處理下掃描圖譜差異明顯，接種蠟狀芽孢桿菌后李氏禾根系分泌物的特征峰明顯少于前兩種未接種情況下的根系分泌物特征峰。

圖3 無鉻條件下李氏禾根系分泌物GC-MS掃描圖譜Fig. 3 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz without Cr stress

圖4 10 mg·L-1 Cr6+脅迫下李氏禾根系分泌物GC-MS掃描圖譜Fig. 4 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz with 10 mg·L-1 Cr6+ stress

圖5 接種蠟狀芽孢桿菌后李氏禾根系分泌物GC-MS掃描圖譜Fig. 5 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz inoculated with Bacillus cereus

通過人工分析質譜圖并與 NIST107質譜數據庫核對分析，確定出3種處理條件下李氏禾根系分泌物的有機物質及相對含量用以進一步分析，見表1—3。

由表1和表2結果分析，無Cr6+處理和有Cr6+處理10 d后的根系分泌物分別檢測出41種、47種有機化合物，都包含烷烴、酯、烯烴、芳香烴、醇、醚、酰胺。其中相對含量超過5%的物質有3種，分別是烷烴、芳香烴、酰胺。由表3分析，接種蠟狀芽孢桿菌處理10 d后的根系分泌物檢測出19種有機化合物，含烷烴、醇、酯、酚，相對含量超過5%的物質有烷烴、酯、酚。未接種蠟狀芽孢桿菌的李氏禾根系分泌物主要成分是烷烴，芳香烴，酰胺類物質，且Cr6+脅迫下根系分泌物的種類顯著增加并分泌出大量的化感物質。未接種蠟狀芽孢桿菌的李氏禾根系分泌物種類未見減少，也沒有特別限制某一類化合物的分泌，表明李氏禾對Cr6+具有很強的耐受能力。而接種了蠟狀芽孢桿菌的李氏禾，根系分泌物有機化合物數量的減少，說明蠟狀芽孢桿菌將根系分泌物作為生長代謝底物而分解掉，為自身的繁殖生長提供碳源等物質。有學者發現油菜幼苗根系分泌物成分主要包含烴、醇、酯等且烴類化合物相對含量最高（張紅等，2014）。吳蕾等（2009）研究大豆、小麥、玉米、高粱的根系分泌物，發現其成分包括烷烴、酸、醇、酯、苯、酰胺、酮、醛、酚以及其他物質，與本研究得出的主要根系分泌物種類特征相似。

植物的根系分泌物成分主要受物種的基因控制，但是植物的生長環境也是因素之一，所以根系分泌物的種類和數量受植物自身生長狀況和環境條件影響（羅曉蔓等，2019）。比如小麥在鎘脅迫下的一些次生代謝產物的根系分泌物具有明顯變化，小麥通過改變根系分泌物作用而緩解鎘危害（張玲等，2002），楊瑞吉等（2006）研究發現油菜在磷脅迫下根系分泌物包括烷烴、烯烴、苯、酸、醛、酯、酮、醚等有機化合物，且在磷脅迫下，油菜根系分泌物種類增加，這都是植物通過調節根系分泌物的組成來改變根系狀態以適應新的外界環境。此外，一些根系分泌物能對重金屬產生吸附、絡合作用，減輕重金屬生物毒性。由表1、2可見，李氏禾根系分泌物中酰胺類物質前后含量的變化可能是受到鉻脅迫后的一種根際解毒機制，為了證實這一點，我們還需要進一步研究李氏禾在鉻脅迫下根細胞膜的受損程度，透性變化情況以及植物根際pH環境、Eh特征變化等。

表1 根系分泌物的鑒定（空白組）Table 1 Identification of root exudates (blank control group)

2.3 Cr6+脅迫下根系分泌物化感物質分泌差異

從表2、表3鑒定出來有機物的相對含量分析，李氏禾根系分泌物主要包括烷烴、芳香烴、酰胺等物質，其中不少有機化合物被報道是化感物質（Sun et al.，2019；李楊瑞，1993）。在Cr6+脅迫下，李氏禾根系分泌物中都檢測到了有且僅有一種酚類物質：2, 4-二叔丁基苯酚。有學者認為苯甲酸及其衍生物、水溶性有機酸、酚類，及烷烴類等化合物都屬于化感物質，對植物具有化感作用，且相對含量高的物質一般可能起主要的化感作用（Buer et al.，2010），而本文檢測出的2, 4-二叔丁基苯酚是一種已經被證實具有化感效應的有機化合物（張新慧等，2008）。黃翔杰等（2017）研究野菊根系分泌物中發現2, 4-二叔丁基苯酚對生菜、萵苣、油菜有明確的化感效應，周寶利等（2010）發現對嫁接茄幼苗施加低濃度的2, 4-二叔丁基苯酚有明顯的促生長作用，但是對茄子幼苗施加高濃度的2, 4-二叔丁基苯酚處理反而對生長特性具有抑制作用（王玉潔等，2007）。

表2 根系分泌物的鑒定（有Cr6+）Table 2 Identification of root exudates (under Cr stress)

表3 根系分泌物的鑒定(有微生物)Table 3 Identification of root exudates (microorganism)

本文研究發現接種蠟狀芽孢桿菌與未接種相比，檢測出的2, 4-二叔丁基苯酚含量更高，相對含量從0.16%升高到6.07%。Li et al.（2019）在研究蠟狀芽孢桿菌 BCM2定殖番茄根系防疫根結線蟲試驗中，發現番茄根系分泌物中的2, 4-二叔丁基苯酚顯著增加，與本研究結果一致。李氏禾根系分泌物2, 4-二叔丁基苯酚相對含量的變化是超富集植物李氏禾對重金屬逆環境刺激的一種潛在響應機制。

3 結論

（1）李氏禾根系分泌物和蠟狀芽孢桿菌相互作用對水體中Cr6+的還原率高達99%，遠大于李氏禾根系分泌物或者蠟狀芽孢桿菌單獨處理組，表明接種蠟狀芽孢桿菌是提高李氏禾修復鉻污染水體效率的一種有效方法。

（2）李氏禾根系分泌物種類繁多，成分復雜，包含烷烴、酯、烯烴、芳香烴、醇、酰胺，其中以烷烴、芳香烴、酰胺為主。向李氏禾接種蠟狀芽孢桿菌后，大部分李氏禾根系分泌物中的化感物質被分解掉，降低了化感物質對植物的毒害作用。

（3）李氏禾在受到Cr6+脅迫后，酰胺類物質的含量變化可能是植物為適應重金屬鉻環境變化的一種解毒機制；李氏禾根系分泌物中的化感物質2,4-二叔丁基苯酚是李氏禾對鉻脅迫的一種潛在的生理響應機制。