揮發油類中藥主要化學成分安全性預測研究＊

馮小龍

（石家莊學院化工學院 石家莊 050035）

中藥在中華民族幾千年的疾病抗爭史上發揮著不可替代的作用，對中華民族的繁榮昌盛有著巨大貢獻，并逐漸為歐美國家關注，在國際醫藥市場和食品保健用品市場上銷量不斷上升。隨著我國醫藥衛生健康產業的穩步發展，中藥在臨床治療和養生保健方面的地位迅速攀升，但近年來隨著中藥應用范圍的擴大，中藥中毒事件、中藥藥源性肝損傷等不良反應事件[1]時有報道，人們對中藥的安全性產生了質疑，否定中醫藥和蔑視中醫藥的聲音時有發出，對中藥的臨床應用、中藥現代化與國際化均造成了較大影響。因此對中藥安全性進行多方面研究，加深對中藥特性的了解，對促進我國中藥事業的健康發展，加快中藥現代化國際化進程有著重要意義。

含揮發油類成分的中藥品種較多，現行2015 版《中國藥典》中收錄618 種中藥中有196 種含有揮發油類成分，其中37種以揮發油含量作為質量評價指標[2]。揮發油類成分是很多中藥的主要藥效成分，具有抗菌、抗炎、抗癌、促進藥物吸收等生物活性，在臨床上應用非常廣泛，常用于心腦血管、中樞神經、呼吸、胃腸道系統等疾病的治療。隨著臨床應用及基礎研究的深入，有研究發現揮發油類成分在發揮治療作用的同時具有毒性，認為中藥揮發油類成分是引起毒性反應的重要物質之一[3]，如常用中藥薄荷揮發油，大劑量服用可致中毒[4]，柴胡揮發油可致肝細胞損傷[5]，由薄荷油和藏茴香油組成分在研中藥新藥，II 期臨床研究中發現可導致肝功能輕度異常[6]。

中藥安全性一直是中醫藥研究的短板，法規和技術等因素均影響了我們對中藥的認識。從藥物研發法規來看，我國對中藥安全性研究的起步較晚，如中藥遺傳毒性研究，在20 世紀70 年代以后逐步得到重視。1985 年開始實施的《新藥審批辦法》中規定了對新藥的特殊毒理學研究要求。但與其他國家的要求相比較，我國對中藥的特殊毒理學評價要求相對較低，直到2007 年版藥品注冊管理辦法才提出具體要求，對于創新程度較高及用于育齡人群并可能對生殖系統產生影響的新藥應報送遺傳毒性資料，對其它類別的中藥仍無規定，但中藥成分具有致突變性作用時有報道，如吳茱萸醇提取物無遺傳毒性，但吳茱萸次堿和檸檬苦素有致突變性，可使細胞染色體畸變率增加；細辛水煎液能明顯誘發小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核和小鼠精子畸形，具有致突變作用等[7]。從技術角度分析，由于揮發油類成分復雜、性質不穩定，分離提純困難，采用傳統方法進行毒理學研究需花費大量時間、物力，因此目前對揮發油類成分的毒理學研究資料較少，認識尚不充分，已有實驗報道中試驗樣品多采用含復雜成分的粗提物[8,9]，得出的結論簡單，影響臨床應用。為了正確認識揮發油類成分的毒性特點，急需采用新技術新方法，加強對中藥揮發油類成分安全性的多方面研究[10]，明確毒性物質基礎，以指導臨床合理用藥及新藥研發。

定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）[11]法通過化合物分子本身的特征，計算分子化學結構的參數，運用統計方法或者機器學習算法，建立分子結構參數與毒性終點關系模型，以預測未知化合物的毒性，在合成藥物及中藥安全性評價中已經廣泛應用，此方法可以實現對大量化學成分的安全性全面分析，可用于含有復雜化學成分的中藥提取物的研究。通過收集中藥成分毒性數據，驗證了兩軟件中肝毒性、急性毒性、雌激素受體作用以及CYP 抑 制 模 型 ，證 明 ADMET Predictor 與 Virtual Tox Lab 均可應用于中藥成分預測[12]；采用QSAR 模型對1692 個中藥化學成分進行急性毒性預測研究，證明了結果具有參考意義[13]；采用多元線性QSAR 模型對黃酮類化學成分調節P-糖蛋白功能作用進行了研究，發現預測結果準確性較高[14]。QSAR 法可以實現對化學成分毒理學的快速全面分析，符合毒理學研究3R 趨勢，可替代常規動物實驗，并可以彌補中藥化學成分單體難以獲得無法進行實驗的不足，還可避免采用粗提物進行實驗而得出中藥有毒性的片面性結論，為中藥安全性評價提供新的途徑和方法。

本研究主要采用QSAR 法，對收集的中藥揮發油類主要化學成分進行全面的潛在毒性分析，同時結合已有文獻數據，實現對中藥揮發油類成分的安全性的全面認識，明確毒性與化學成分之間的關系，彌補采用粗提物進行毒理研究時毒性成分定性不準確的不足，同時可部分替代傳統實驗，節約資源，提高效率，并為此類藥物的臨床合理應用及深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 揮發油類化學成分信息收集

選取2015 年版《中國藥典》一部中45 種含揮發油類成分的中藥，其中以揮發油為含量測定指標的中藥材37 種[8]（八角茴香、薄荷、藏菖蒲、草豆蔻、草果、當歸、豆蔻、莪術、楓香脂、甘松、干姜、紅豆蔻、花椒、姜黃、降香、荊芥、荊芥穗、沒藥、佩蘭、片姜黃、羌活、肉豆蔻、肉桂、乳香、砂仁、山柰、生姜、石菖蒲、檀香、細辛、香附、香薷、小茴香、辛夷、益智、油松節、紫蘇葉），已報道揮發油類成分有肝毒性的中藥7 種[15]（蒼術、柴胡、川楝子、吳茱萸、艾葉、山胡椒、小茴香），根據藥典中含量測定指標成分或文獻報道含量較高的成分[16-34]，共篩選出揮發油類主要化學成分181 個，按結構特點分為9個大類，包括醛類15個、烯類39個、酮類27個、酯類17個、醇類31個、烷類15個、酚類18個、醚類11 個和酸類8 個。收集揮發油類主要化學成分相關信息，包括化學名稱、英文名稱、化學結構式、CAS號等，由Pubchem 下載化學成分分子結構文件，未能下載的使用ChemDraw 畫出分子結構式，用于預測分析。

1.2 預測軟件

ADMET Predictor，9.5 版，美國 Simulation Plus 公司開發，是一款基于定量構效關系模型（QSAR）的毒理學和藥代動力學性質預測軟件，可應用于早期藥物開發毒性篩選[35]。該QSAR 模型是利用世界藥物索引中2000 多種藥物分子信息和專有的人工神經網絡集成技術開發并經過驗證的預測軟件。詳細的模型描述、驗證結果可參考官方網站和ADMET 預測軟件用戶手冊。選擇肝毒性、致突變性、心臟毒性和對CYP酶抑制活性預測模塊對化學成分的安全性進行預測分析。

1.3 評價標準

采用pH 值7.4 的默認設置，評價指標采用軟件默認的指標，其中肝毒性采用ALT、AST 和LDH 同時升高標記為具有肝毒性[36]；對CYP 酶預測選擇是否抑制CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4 等5 種酶的活性；心臟毒性選用hERG 的抑制指標，遺傳毒性選擇致突變性指標。同時參考文獻報道的實驗數據，對181個主要成分的安全性進行綜合分析。

表1 揮發油類主要化學成分肝毒性實驗數據匯總

2 結果

2.1 肝毒性

2.1.1 肝毒性實驗數據

181個化學成分中，22個（12.1%）具有基礎毒性實驗數據，其中1 個化學成分（薄荷醇）明確無毒性，1 個化學成分（麝香草酚）有肝臟保護作用，20個化學成分具有肝毒性。文獻報道的肝毒性以大鼠的長期毒性實驗數據為主，給藥周期均較長，最短30 天，最長達103 周，因此試驗結果具有重要的參考意義，主要毒性反應為引起動物肝臟重量增加，其中5 個化學成分的肝毒性劑量小于100 mg·kg-1，包括甲基丁香酚、香荊芥酚、檸檬烯、草蒿腦、左旋香芹酮，其中甲基丁香酚毒性最強，劑量為30 mg/kg/d，相當于人體等效劑量為300 mg/天，甲基丁香酚在細辛中的含量最高（1%），2015 版藥典中細辛的用量為1-3 g，按此劑量用藥，甲基丁香酚的攝入量可達30 mg/天，安全范圍可接受。對于含此類成分的藥材，需加強藥學研究，測定毒性成分的含量，確保用藥安全劑量，并在臨床應用中觀察不良反應。15個化合物的毒性劑量大于100 mg·kg-1，包括α-蒎烯[37]、薄荷酮[38]、庚醛、香葉烯、異薄荷酮、(E)-香葉醇、左旋乙酸冰片酯、正二十烷、芳樟醇、α-細辛醚、桉葉油素（桉樹腦）、(Z)-檸檬醛、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯和香葉醛，多種藥材中均含這些成分。此類成分雖有毒性，但安全范圍較寬，臨床應用時應注意用藥周期及給藥劑量，以保障用藥安全。

2.1.2 預測研究肝毒性結果

QSAR 研究結果表明（表 2），有63 個化學成分具有肝毒性，占全部化學成分的34.8%。醛類化合物雖然較少，但80%成分（12 個）具有肝毒性，包括：3,4-二甲基-3-環己烯甲醛、左旋紫蘇醛、1-甲基-3-環己烯-1-吡咯甲醛、香茅醛、(E)-檸檬醛、2-癸烯醛、2,4-十二碳二烯醛、桂皮醛、2,4-癸二烯醛、4,4-二甲基-5-壬烯醛、(Z)-檸檬醛和香葉醛；其次烯類和酮類化合物發生肝毒性的比率相對較高，分別為59%和55%；酯類、醇類和烷類毒性發生率較低；酚類、醚類和酸類物質基本無肝毒性。

表2 揮發油類主要化學成分肝毒性預測結果

2.1.3 肝毒性綜合分析

綜合分析表明，181個主要成分中，77個化學成分有肝毒性（42%），其中醛類發生率高達87%，烯類、酮類化合物發生肝毒性的比率超過60%。文獻報道有肝毒性，QSAR 預測也有肝毒性的化合物共6 個，分別是α-蒎烯、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯、左旋香芹酮、(Z)-檸檬醛、香葉醛。此結果表明，揮發油類成分長期應用具有肝毒性風險，其中醛類成分的風險最高，其次是烯類和酮類，對含有此類成分的藥材應加強質量研究，可根據此類成分在藥材中的含量制定質量控制指標，確保臨床用藥安全。

2.2 致突變性

軟件主要是對Ames 試驗（10 株沙門氏菌）進行預測分析（表3），發現有6種成分提示有致突變性，包括，3-苯基-1-乙酰唑胺-二環[1.1.0]丁烷、乙酰丁香酮、木蘭脂素、2,3-二甲基-3-已醇、異歐前胡素和托酚酮，分別為柴胡、艾葉、吳茱萸、花椒、辛夷、阿魏、羌活和沒藥揮發油的主要化學成分。化學結構式見圖1，這6種成分結構差異較大，無明顯共性結構，提示此類物質致突變性無明顯的規律可尋。有文獻報道[46]，甲基丁香酚體外Ames 試驗證明無致突變作用，但動物實驗發現有致癌性，認為甲基丁香酚是一種人類致癌物。經檢索危險物質數據庫（HSDB）等專業網站發現，有11 個成分已有實驗表明無遺傳毒性，包括乙酸香葉酯、香茅醛、(Z)-檸檬醛、庚醛、香葉烯、草蒿腦、乙酸橙花酯、香葉醛、檸檬烯、芳樟醇、麝香草酚（百里酚）。

表3 揮發油類主要化學成分致突變性預測結果

圖1 致突變性揮發油類化學成分結構式

結果表明，揮發油類成分遺傳毒性研究較少，僅有6%的化學成分有實驗報道，但因遺傳毒性是毒理學的重要指標，因此后期應加強實驗驗證研究，特別是預測結果為陽性的6 個成分，針對含此類成分含量較高的藥材進行開發時應加強質量控制，并進行相關毒理學實驗研究。

2.3 心臟毒性

預測軟件以化學成分對hERG 編碼的鉀離子通道結合力作為評價指標，對hERG 鉀通道的抑制作用可引發致命性心律失常，因此含此類成分的藥物有心臟毒性風險。研究發現，共有6 個化學成分顯示hERG陽性（表4），包括：木蘭脂素、榿木酮、去氫二異丁香酚、菜油甾醇、N,N'-二乙基二苯脲和3-羥基-6β-環丙烷-5β-膽甾烷，分別為辛夷、草豆蔻、肉豆蔻、蒼術和小茴香揮發油類的主要化學成分，化學結構式見圖2。

2.4 CYP450酶抑制

本研究中探討了化學成分對5 種CYP450 酶的抑制作用（表5），結果表明，揮發油類化學成分對CYP2C9 酶抑制作用最明顯，有58%的化學成分對其有抑制作用，除酸類化學成分外，各類成分均有抑制作用；36.5%的化學成分對CYP2C19 酶有抑制作用，其中醛類、烯類、酮類和醇類作用明顯；對CYP3A4 酶有抑制作用的化學成分較少，包括少量的酯類、烷類和酚類化學成分。酸類物質抑制作用較為集中，只對CYP2C9酶有抑制作用。

表4 揮發油類主要化學成分心臟毒性預測結果

圖2 心臟毒性揮發油類化學成分結構式

表5 不同類別化學成分對5種CYP酶的抑制作用

總體分析，中藥揮發油類成分對肝藥酶有一定的抑制作用，主要是對CYP2C9 酶和CYP2C19 酶有抑制作用的成分較多，但對活性最強的CYP3A4 酶有影響的成分較少。CYP2C9 酶和CYP2C19 酶分別參與了16%和2%臨床常用藥物的代謝[15]，主導部分心血管、抗精神病及抗凝血等藥物的體內代謝，因此與這些藥物同時應用時有可能增加臨床風險，應重點關注。

3 討論

在肝毒性研究中發現，預測研究結果與已有毒性實驗結果之間存在差異，可能與觀察指標不同有關。已有的實驗數據表明，揮發油類成分在動物體內大劑量、長期內用時可造成以肝臟重量升高為主的毒性反應，而預測學研究以轉氨酶的變化為主要指標。揮發油類部分成分雖有肝毒性風險，推測毒性多在大劑量、長期內服時發生，大部分藥材在臨床上可安全使用，對于毒性成分含量較高的中藥材，在臨床應用時重點關注藥物在臨床常用劑量下對轉氨酶的影響，同時為保證臨床用藥安全，可制定質量標準監測毒性成分含量并控制使用劑量。

預測結果表明少量的化學成分具有致突變性，此類成分雖然數量較少，但其毒性風險較高，在多種藥材中均含有此類成分，如甲基丁香酚是細辛[47]和石菖蒲[48]揮發油的主要成分之一；木蘭脂素是辛夷[49]揮發油的主要成分之一，因此建議對含有此類成分藥中藥進行新藥開發時應開展詳細的臨床前遺傳毒性評價研究。

通過QSAR 預測研究，可以實現對多種成分多方面安全性的定性分析，可為后期實驗研究提供重要依據，不足之處是無法與用藥劑量相結合實現對用藥安全性的快速判斷。本研究中結合已有實驗數據、預測結果及藥典規定的用法用量，實現了對肝毒性的預測分析，對于致突變性及心臟毒性還需積累實驗數據，才能得出更加準確的結論。

本研究采用QSAR 預測與文獻報道相結合的方法，對181 個揮發油類化學成分的肝功毒性、心臟毒性、遺傳毒性及對肝藥酶活性的影響等進行了系統的研究與分析，結果表明，揮發類成分安全性較好，以醛類成分為代表的少部分化學成分肝毒性發生率較高，主要的毒性表現是轉氨酶升高；極少量化成分可能具有心臟毒性或遺傳毒性；除部分化學成分對參與體內其它藥物代謝相對較少的CYP2C9酶和CYP2C19酶有抑制作用外，僅少數化學成分對最重要的CYP3A4 酶有抑制作用。