北柴胡轉(zhuǎn)錄因子BcbZIP179的基因克隆及原核表達＊

韓文靜，徐 嬌，朱楚然，隋 春，魏建和

（中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室 北京 100193）

傘形科柴胡屬多年生草本植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.)，是我國藥典規(guī)定的中藥柴胡的基原植物之一。柴胡皂苷是北柴胡的主要藥效成分之一，具有抗炎、保肝、提高免疫力等作用[1]。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子，是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛的家族之一[2]，植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)節(jié)多種生理功能，包括調(diào)節(jié)生長發(fā)育、調(diào)節(jié)次生代謝及生物與非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[3-4]。根據(jù)擬南芥堿性區(qū)域及其他保守區(qū)域的相似性78 個bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可劃分為13個組（A-I，S，M，K，J），同一組bZIP轉(zhuǎn)錄因子往往具有相似的結(jié)構(gòu)特征及功能[5-6]。本研究在生物信息分析轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄因子基因[7]基礎(chǔ)上，從北柴胡中克隆了1 個編碼bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的基因BcbZIP179，其氨基酸序列與胡蘿卜（Daucus carotaL.）中的類bZIP53 蛋白同源性最高。利用qRT-PCR 對BcbZIP179的組織表達特性及受MeJA 誘導(dǎo)的表達特性進行分析，BcbZIP179可能與植物次生代謝相關(guān)。利用原核表達系統(tǒng)摸索出BcbZIP179適宜表達條件，獲得體外表達的融合蛋白，為制備抗體、分離互作蛋白和調(diào)控靶基因奠定基礎(chǔ)，為進一步研究其功能提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

所用北柴胡品種中柴2號種植于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所藥用植物栽培育種試驗地。BL21（DE3）、Transetta（DE3）菌株和原核表達載體 pET-28a、pEASY-Blunt E1 購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 試劑

高 保 真 DNA 聚 合 酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）、PrimeScript? RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司購買；RNA 提取試劑盒（Total RNA Purification Kit，LC Sciences，Houston，USA）、DNA 純化回收試劑盒（Universal DNA Purification Kit）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIAN prep Mini Plasmid Kit）于天根生物科技有限公司購買；BamHI 和EcoRI 內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶于 NEB 公司購買[8]；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于北京康為世紀生物科技有限公司購買；SDS-PAGE預(yù)制膠于Bio-Rad公司購買。

1.3 RNA提取與cDNA合成

采集二年生盛花期北柴胡的根、莖、葉、花、果實，以單株為生物學重復(fù)，重復(fù)3 次，樣品在液氮中速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩１辈窈欢ǜ囵B(yǎng)參照文獻報道[9]。將培養(yǎng)21 天的不定根剪成約0.5 cm 的小段，更換到含有 0（CK）和 200 μmol·L-1MeJA 的培養(yǎng)基中，24℃、100 r·min-1振蕩暗培養(yǎng)，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和 5 天時取樣，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩NA 提取和cDNA 第1 鏈的合成均按照試劑盒說明書進行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BcbZIP179基因的全長克隆及序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄因子基因序列，設(shè)計特異性引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進行PCR 擴增，獲得BcbZIP179的全部基因編碼序列。利用在線軟件ExPASy-PROSITE 確定BcZIP179的特征性bZIP 區(qū)域位置，ProtComp9.0 進行亞細胞定位，NLSMapper 進行核定位信號預(yù)測，TMHMM Server v.2.0 進行跨膜結(jié)構(gòu)分析，SOPMA 進行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，氨基酸序列比對在NCBI 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進行。利用MEGA X 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1000次。

表1 實驗用引物

1.5 BcbZIP179基因表達分析

以MeJA 處理的北柴胡不定根及北柴胡植株不同組織器官為材料，內(nèi)參基因為Actin和β-Tublin，qPCR反應(yīng)使用LightCycler 96 實時熒光定量PCR 儀進行。SYBR Premix Ex Taq II（2×）7.5 μL，cDNA（100 ng·μL-1）0.8 μL 作為 PCR 反應(yīng)體系（15 μL），上下游引物（10 mmol·L-1）各 0.2 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR 擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；58℃，30 s，40 個循環(huán)。3 次技術(shù)重復(fù)。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.6 原核表達載體構(gòu)建

將BcbZIP179編碼區(qū)分別插入表達載體pET-28a和pEASY-Blunt E1 Vector 中，菌液PCR 驗證后選擇陽性克隆測序，序列比對完全正確的克隆（分別命名為E2-BcbZIP179 和E1-BcbZIP179）用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和Transetta（DE3）感受態(tài)細胞，同時轉(zhuǎn)化空載體作為對照。

1.7 原核表達條件摸索

將轉(zhuǎn)化的空載體、重組質(zhì)粒E1-BcbZIP179 和E2-BcbZIP179 的表達菌株單克隆接種于含Amp（氨芐青霉素50 mg·L-1）的 LB 液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1，37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，再按照1∶50 比例在新的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm 約為0.6，加入IPTG 至終濃度分別為 0.5 和 0.05 mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng) 12-16 h，設(shè)置37℃和16℃誘導(dǎo)表達溫度，離心收集菌體，加上樣緩沖液沸水浴變性5 min后，10%SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 北柴胡BcbZIP179的序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計一次性擴增BcbZIP179編碼區(qū)的特異引物，經(jīng)PCR、PCR 產(chǎn)物電泳、目的片段回收、克隆和測序，獲得編碼序列長435 bp 的BcbZIP179基因，推測編碼144 個氨基酸。NCBI BLASTx 結(jié)果顯示，BcbZIP179與不同物種中的 bZIP53 或類 bZIP53 蛋白序列一致性比較高，其中與胡蘿卜中的類bZIP53蛋白序列一致性最高，為78.62%（圖1）。SMART 結(jié)構(gòu)域分析顯示，在BcbZIP179的第23-86 氨基酸位置為bZIP 特征結(jié)構(gòu)域，說明屬于S 亞家族，在結(jié)構(gòu)上和S 亞家族的擬南芥具有相同的保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。

利用ExPASy-PROSITE 分析結(jié)果顯示BcbZIP179其bZIP 結(jié)構(gòu)域在26-76 位氨基酸位置，利用ProtComp 9.0 在線軟件與NLS Mapper 分別預(yù)測出該轉(zhuǎn)錄因子具有核定位信號，和其核定位信號存在于該蛋白氨基酸序列的第3-32 位，說明BcbZIP179具有轉(zhuǎn)錄因子特征。利用TMHMM Server v. 2.0 軟件預(yù)測顯示不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，而根據(jù)SOPMA 軟件二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白符合亮氨酸拉鏈主要由α-螺旋組成的結(jié)構(gòu)特點，預(yù)測結(jié)果顯示：氨基酸序列含有66.67%α-螺旋，且第20-110位氨基酸之間主要為α-螺旋。

2.2 BcbZIP179基因表達分析

2.2.1BcbZIP179基因在北柴胡不同組織中的表達分析

在北柴胡不同組織器官中，根據(jù)qRT-PCR方法檢測BcbZIP179基因的相對表達量，表明在北柴胡各器官中BcbZIP179均有表達，其中果實的表達量最高，其次是莖中的表達量高于根、葉和花（圖3）。

2.2.2BcbZIP179基因受MeJA誘導(dǎo)的表達分析

利用qRT-PCR 方法檢測BcbZIP179基因在MeJA處理的不定根中的表達，結(jié)果表明，BcbZIP179在MeJA 處理后的24 h 內(nèi)，表達量逐漸升高，隨后表達量降低（圖4），但仍高于對照。MeJA 誘導(dǎo)的基因通常與次生代謝相關(guān)，提示該轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控柴胡次生代謝。

2.3 BcbZIP179原核表達

為了獲得體外表達的BcbZIP179蛋白，用于后續(xù)BcbZIP179基因功能分析，采用2 種原核表達載體和2種表達菌株，在不同IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)表達溫度條件下，進行了BcbZIP179的原核表達分析。首先構(gòu)建原核表達載體，并能夠從重組載體上酶切到與預(yù)期片段大小一致的條帶。通過對較，采用Transetta（DE3）菌株比BL21（DE3）菌株的效果更好，低溫16℃的誘導(dǎo)效果優(yōu)于37℃。IPTG 的濃度對表達量的影響不大，0.05 mmol·L-1和 0.5 mmol·L-1條件下，表達量沒有明顯差異（圖5）。

圖1 BcbZIP179與其它物種bZIP53的系統(tǒng)進化樹

圖2 BcbZIP179與AtbZIP53(Arabidopsis)的氨基酸序列比對

圖3 BcbZIP179在北柴胡不同器官中的表達分析

圖4 BcbZIP179受MeJA誘導(dǎo)的表達分析

圖5 BcbZIP179重組蛋白的原核表達

3 討論

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄因子基因分析顯示，不同物種中bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)目差異較大。擬南芥中有78 個bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，水稻中有92 個，玉米中有125 個，油菜籽有247個[10]。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多，但只有少數(shù)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的功能在特定植物中得到解析[11-12]，更多bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中的表達調(diào)控機制還不清楚。目前已知bZIP 轉(zhuǎn)錄因子主要通過調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育與環(huán)境變化的應(yīng)答反應(yīng)。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控萜類化合物、黃酮類化合物及生物堿等多種化合物的合成，能夠增強植物的抗病性，適應(yīng)低溫脅迫，提高植物抵抗環(huán)境脅迫的能力。同時bZIP 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控植物的生長、發(fā)育、開花及結(jié)果。大量研究表明次生代謝產(chǎn)物是許多藥用植物的主要活性成分。bZIP轉(zhuǎn)錄因子不僅能夠提高植物的抗逆性，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，還可以有效提高藥用植物中有效成分的含量[4]。本研究獲得了北柴胡中的1 個bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因BcbZIP179，并進行了生物信息學分析。北柴胡BcbZIP179屬于類bZIP53轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中的bZIP53研究較多，多與種子的成熟及幼苗形成有關(guān)[13-14]，也與擬南芥在逆境下的氨基酸代謝調(diào)控有關(guān)[15]。BcbZIP179在北柴胡各個組織器官中均有表達，但在果實中的表達高于其它組織器官，所以該基因可能與果實的成熟有關(guān)。BcbZIP179的表達還受MeJA 誘導(dǎo)，在處理的24 h時，表達量最高。MeJA 通常誘導(dǎo)脅迫條件下的次生代謝，所以該基因可能參與植物次生代謝的調(diào)節(jié)。BcbZIP179是否參與植物的次生代謝調(diào)節(jié)，具有與擬南芥bZIP53相似功能，有待進一步探究。

bZIP53 屬于bZIP 家族中的S1 組，以往研究顯示S1 組成員往往與C 組成員相互作用，共同起調(diào)控功能[7]。為深入研究BcbZIP179的調(diào)控機制，有必要獲得北柴胡體內(nèi)與之相互作用的的蛋白及調(diào)控的靶基因，為此，本研究利用原核表達系統(tǒng)，獲得了體外表達的BcbZIP179融合蛋白，為后續(xù)制備抗體，篩選BcbZIP179調(diào)控的靶基因，深入開展BcbZIP179的基因功能研究提供了條件。