非小細胞肺癌RAGE/S100P與STAT3/Pim1表達及意義

[摘要]目的 探討非小細胞肺癌（NSCLC）組織晚期糖基化終末產物受體（RAGE）/S100P、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）表達及其意義。

方法收集NSCLC及其癌旁組織標本各40例，應用Westernblot方法和RT-PCR方法檢測其RAGE、S100P、STAT3和Pim1的表達，并分析不同臨床病理特征病人的表達差異。

結果

肺癌組織中RAGE蛋白表達明顯低于癌旁正常組織，兩組比較差異有統計學意義（t=5.756，Plt;0.05）;S100P、STAT3和Pim1蛋白在肺癌組織中表達明顯高于癌旁正常組織，兩組比較差異有統計學意義（t=2.414～10.141，Plt;0.05）。RT-PCR結果顯示，與癌旁正常組織相比，RAGEmRNA在癌組織中表達明顯減少（t=21.530，Plt;0.05），而S100P、STAT3、Pim1mRNA在癌組織中表達明顯增多（t=10.430～13.640，Plt;0.05）。RAGEmRNA表達量在腺癌組織中高于鱗癌組織，在高中分化組織中表達高于低分化組織，在伴有淋巴結轉移的癌組織中表達明顯低于不伴有淋巴結轉移癌組織，差異有統計學意義（t=2.157～2.908，Plt;0.05）。S100PmRNA在鱗癌組織中的表達高于腺癌組織，在低分化組織中表達高于高中分化組織，在伴有淋巴結轉移癌組織中的表達高于不伴有淋巴結轉移癌組織，差異有統計學意義（t=2.132～2.590，Plt;0.05）。Pearson相關性分析顯示，NSCLC組織RAGE表達與S100P表達、STAT3表達呈負相關（r=-0.430、-0.417，Plt;0.05），STAT3表達與S100P表達、S100P表達與Pim1表達、Pim1表達與miR-21表達呈正相關（r=0.324～0.337，Plt;0.05）。

結論RAGE、S100P及STAT3、Pim1可能參與NSCLC的發生發展。

[關鍵詞]癌，非小細胞肺;高級糖化終產物受體;S100蛋白;信號轉導和轉錄激活因子3;Pim1

[中圖分類號]R730.26

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2020）01-0040-05

肺癌是我國發病率和死亡率均較高的一種惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌病人的80%～85%[1]。多數病人早期無明顯癥狀及體征，就診時多處于中晚期，治療困難，預后較差。早期肺癌治療以手術切除為主，中晚期肺癌手術切除配合放化療、靶向治療及免疫治療等綜合措施[2-3]。肺癌發生發展涉及多種細胞因子、多條信號通路，其發病機制一直是研究熱點。晚期糖基化終末產物受體（RAGE）是一種跨膜的信號轉導受體，屬于免疫球蛋白超家族，與相關配體結合后，會激活胞內多種信號轉導通路，引起相應的生物學效應[4-5]。RAGE在惡性腫瘤如肝癌、胃癌、胰腺癌及前列腺癌等的表達異常增加，與癌細胞的增殖、遷移、侵襲及腫瘤的分期和預后等密切相關[6-10]。S100蛋白（S100P）屬于鈣結合蛋白家族，可以與RAGE結合介導腫瘤如黑色素瘤的發生[11-12]。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）為常見癌基因之一，其異常激活與腫瘤的生物學效應密切相關[13-14]。Pim-1是一種癌基因，有研究表明Pim-1是細胞因子信號通路傳導的下游效應因子，能夠通過改變細胞周期調節因子的活性而縮短細胞周期，參與調控細胞的增殖、分化和凋亡[15]。本文研究采用Westernblot和RT-PCR方法，分別檢測NSCLC病人癌組織及其癌旁組織中RAGE、S100P、STAT3和Pim1蛋白和基因表達，分析其在病人不同臨床病理特征下的差異性表達，旨在探討以上因子在NSCLC中的表達和意義。

1材料與方法

1.1標本及其來源

標本來自2018年4—8月青島大學附屬醫院胸外科手術切除且病理證實為NSCLC的病人（均由兩位病理醫師獨立診斷），共40例，男24例，女16例;年齡43～81歲，中位年齡61歲。病人臨床資料完整，術前均未行其他抗腫瘤治療。標本為每例病人的肺癌組織及對應的癌旁正常肺組織（距癌灶邊緣5cm）。研究經青島大學附屬醫院倫理委員會批準，并獲得病人知情同意書。

1.2RAGE、S100P、STAT3等蛋白表達檢測

采用Westernblot方法進行檢測。取凍存肺組織，每250mg組織加入1mLRIPA裂解液，使用勻漿器于冰上研磨組織靜置30min;4℃、12000r/min離心10min，取上清液;行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉移至PVDF膜上，然后用50g/L脫脂奶粉封閉2h，分別加入含對應一抗Anti-RAGE、Anti-S100P、Anti-STAT3、Anti-Pim1（賽爾生物，天津）的Blotto，4℃搖床孵育過夜;再加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗（abcam，USA）Blotto于37℃室溫下靜置孵育1.5h，將膜置于TBST溶液中搖動漂洗5min，共4次;WesternLightningTMChemiluminescenceReagent

顯色劑（PerkinElmer，美國）中顯色30s。

[JP3]最后用LabWorksTM凝膠成像及分析系統（UVP，美國）進行攝像，計算各組蛋白條帶的灰度值，以其表示各蛋白表達。

1.3RAGE、S100P、STAT3及Pim1mRNA表達檢測

采用RT-PCR方法。充分研磨凍存NSCLC組織及癌旁正常肺組織，加入適量裂解液，離心，取上清液，應用Trizol法提取組織總RNA;將3μL總RNA加入到13.5μL反應體系中進行反轉錄，得到cDNA。熒光定量PCR（Takara，Japan）方法擴增RAGE、S100P、STAT3、Pim1及β-actin、U6sn-RNA基因。循環參數為：94℃、4min;94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s;共40個循環。各樣品目的基因和管家基因分別進行熒光定量PCR反應。目的基因擴增產物的相對含量用2-△△Ct表示。各基因引物序列見表1。

1.4統計學分析

應用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料結果用[AKx-D]±s形式表示，數據間比較采用t檢驗;相關性分析采用Pearson相關檢驗法。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1兩種組織中RAGE、S100P、STAT3及Pim1蛋白表達比較與癌旁正常組織相比，肺癌組織中RAGE蛋白表達明顯減少（t=5.756，Plt;0.05），S100P、STAT3、Pim1蛋白表達明顯增高，差異均有統計學意義（t=2.414～10.141，Plt;0.05）。見圖1、表2。

2.2肺癌以及癌旁組織中RAGE、S100P、STAT3及Pim1mRNA表達比較

與癌旁正常組織相比較，肺癌組織中的RAGEmRNA表達明顯減少，S100P、STAT3以及Pim1mRNA表達明顯增多，差異有顯著性（t=10.430～21.530，Plt;0.05）。見表3。

2.3不同臨床病理參數肺癌病人RAGE、S100P基因的差異性表達

RAGE和S100PmRNA表達與肺癌病人的性別、年齡、癌組織大小均無關（P>0.05）;腺癌組織RAGEmRNA表達明顯高于鱗癌組織，高中分化組織表達高于低分化組織，伴有淋巴結轉移肺癌組織中的表達明顯低于不伴有淋巴結轉移肺癌組織，差異均有統計學意義（t=2.157～2.908，Plt;0.05）;S100PmRNA在鱗癌組織中的表達明顯高于腺癌組織，在低分化組織中的表達明顯高于高中分化組織，在伴有淋巴結轉移的癌組織中的表達明顯高于不伴有淋巴結轉移的癌組織，差異有統計學意義（t=2.132～2.590，Plt;0.05）。見表4。

2.4NSCLC組織RAGE、S100P與STAT3/Pim1及miR-21表達相關性

NSCLC組織中RAGE的表達與S100P表達、STAT3表達呈負相關（r=-0.430、-0.417，Plt;0.05），STAT3表達與S100P表達、S100P表達與Pim1表達、Pim1表達與miR-21表達均呈正相關（r=0.324～0.337，Plt;0.05）。

3討論

RAGE作為一種模式識別受體，可以與多種配體結合介導疾病的發生發展。RAGE在肺泡上皮細胞中呈高表達，維持肺泡的正常形態結構及穩定性，介導肺泡上皮細胞與基底膜的黏附;RAGE減少可導致去極化和去分化，細胞功能破壞，與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移有關[16]。已有研究結果發現，RAGE在胃癌、胰腺癌、乳癌等中高表達[6，8-9]，但在肺癌組織中低表達，被認為發揮抑癌基因的作用[5]。目前，對于RAGE-配體結合在腫瘤中的調控機制的研究越來越多，其主要的配體S100家族在其中發揮著重要的作用[17]。S100P與RAGE結合后可以導致ERK1/2發生磷酸化，激活MAPK/ERK信號途徑[18]。有研究表明，S100P在結腸癌、胰腺癌等高表達[19-21]，S100P可能通過與整合素α7相互作用活化激酶FAK和AKT而促進肺癌細胞的轉移和侵襲[22]。在體實驗和細胞實驗發現，Keap1-Nrf2軸可以通過靶向S100P而抑制肺腺癌的遷移和進展[23];AGER/RAGE介導的自噬可能通過IL-6/STAT3信號途徑促進胰腺癌的發生[24]。本文研究結果表明，肺癌組織RAGE蛋白表達低于正常組織，S100P、STAT3和Pim1蛋白表達明顯高于正常組織。此外，我們還發現與癌旁組織相比，肺癌組織中RAGEmRNA表達明顯減少，S100P、STAT3、Pim1mRNA表達明顯增多，與其蛋白水平表達情況一致。說明肺癌病人RAGE表達減少，S100P、STAT3、Pim1表達增多。有研究發現RAGE在肺癌組織中表達較低[5]，基因芯片技術篩選出的差異性基因包括S100P等參與早期NSCLC[25]，JAK/STAT3活化參與NSCLC的發生發展[26]，Pim1在肺腺癌中過表達與腫瘤的侵襲、轉移有關[27]，本文研究結果與以上文獻報道基本一致。本文分析了不同臨床病理參數NSCLC病人RAGE和S100PmRNA表達差異，結果顯示RAGE、S100P表達在不同年齡、性別、腫瘤大小病人間差異無統計學意義;RAGE在NSCLC腺癌中表達較高，S100P在鱗癌中表達較高，提示兩者可能與肺癌的病理形態特征有關;RAGE在高中分化NSCLC組織中表達較高，在無淋巴結轉移的NSCLC組織中表達較高;而S100P在低分化NSCLC組織中表達較高，在有淋巴結轉移的肺癌組織中表達較高，提示兩者可能影響腫瘤的生物學行為，其異常表達可能與腫瘤的增殖、侵襲和轉移有關。RAGE在正常肺組織中高表達，可發揮信號傳導功能和黏附分子的作用，維持正常細胞的增殖、代謝、死亡等;在某些內外刺激的作用下被降解或表達下調，從而導致其調控的下游分子異常表達介導腫瘤發生。結合對其他惡性腫瘤的研究，RAGE及其配體S100P在腫瘤發生發展中的作用機制復雜，在NSCLC中兩者可能存在不同于其他腫瘤中的負反饋調節機制或者拮抗作用，其對腫瘤的作用可能具有雙向性，具體作用取決于組織細胞的類型、細胞所處的微環境和相應的上下游分子等，有待進一步證實。

MELOCHE等[28]通過體外實驗發現，STAT3可以依賴RAGE激活Pim1，通過促進轉錄因子NFAT的表達而促進血管內皮細胞的增殖和抗凋亡;RAGE低表達可減少STAT/Pim1/NFAT的活化，逆轉大鼠損傷的冠脈血管重塑。BLOCK等[29]對胰腺癌細胞研究發現，IL-6可以激活STAT3，上調Pim1的表達，同時IL-6的表達也會因此升高，從而對腫瘤的進展產生正反饋的作用。結腸癌組織中氧化應激反應產生的活性氧可抑制JAK2/STAT3通路，從而抑制Pim1的表達。Pim1作為原癌基因其表達下調會抑制癌細胞生長，促進癌細胞凋亡，使其侵襲轉移受限，從而達到治療的目的[30]。本文相關性分析顯示，RAGE與S100P、STAT3可能存在拮抗作用，S100P、STAT3和Pim1存在協同作用。結合以上文獻報道及本文研究結果，推測RAGE、S100P、STAT3和Pim1及其他下游因子等信號通路可能參與NSCLC的發生發展，有待于進一步研究證實。

NSCLC的發生發展是多因子、多因素共同作用的結果，其確切機制目前還不明確。RAGE、S100P、STAT3和Pim1具有調控細胞增殖、侵襲、分化和凋亡等重要作用，但是其在肺癌發生發展過程中的確切作用尚不清楚，與臨床疾病發展之間的關系尚需要進一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉）