基于“脾為本虛”理論探討左歸復(fù)方對(duì)2型糖尿病小鼠腸道炎癥及黏膜屏障的影響①

向 琴 蔣宛瑾 喻 嶸 鄒曉玲 吳勇軍 劉 秀 劉子毓

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208)

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation,IDF)2017年報(bào)道，中國(guó)大陸20～79歲糖尿病患者數(shù)量為1.144億，位居全球第一。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)約占糖尿病發(fā)病人數(shù)的95%[1,2]。T2DM因其并發(fā)癥多、預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者身心健康。胰島素抵抗和胰島素分泌不足是T2DM發(fā)病的重要病理生理機(jī)制，而全身慢性低度炎癥是引發(fā)胰島素抵抗的重要原因。越來(lái)越多的研究證明，腸道免疫-慢性炎癥在代謝性疾病發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[3,4]。

中醫(yī)藥防治T2DM有著多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。研究表明，中醫(yī)藥在改善糖脂代謝、胰島素抵抗和減輕全身慢性低度炎癥方面療效顯著[5-7]。近幾年來(lái)，中醫(yī)藥從調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫防治T2DM也屢見(jiàn)不鮮[8,9]。左歸復(fù)方為明代著名醫(yī)家張景岳的左歸丸加減化裁而成，根據(jù)T2DM發(fā)病前期“以虛為本”的病機(jī)理論，主以健脾益氣，滋陰養(yǎng)腎。前期研究表明，左歸復(fù)方能降低T2DM小鼠血糖和炎癥因子[10,11]，對(duì)糖脂代謝具有調(diào)控作用，且多靶點(diǎn)[12,13]；能明顯改善“脾腎陰虛”的證候，但治療本虛的機(jī)制尚未明確。本研究以轉(zhuǎn)基因2型糖尿病MKR鼠為研究對(duì)象，通過(guò)觀(guān)察血糖、胰島素水平，檢測(cè)血清中內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)和炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量并檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白及炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)水平，探討2型糖尿病“脾為本虛”的理論機(jī)制及左歸復(fù)方的干預(yù)作用，為中醫(yī)理論提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為左歸復(fù)方防治T2DM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 MKR小鼠由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授權(quán)使用引進(jìn)，是采用組織特異性過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的骨骼肌胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體缺失的非肥胖型2型糖尿病小鼠，經(jīng)自然交配后繁殖的子代用于實(shí)驗(yàn)觀(guān)察。FVB小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2藥物和試劑 左歸復(fù)方由黃芪18 g、生地18 g、山藥9 g、葛根9 g、枸杞9 g、黃連6 g等9味藥組成，藥材購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,煎煮2次后合并煎液，過(guò)濾濃縮至含生藥量1 g/ml，置4℃冰箱備用；胰島素(iNS)、IL-6、IL-1β、TNF-α和LPS ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TLR4/NF-κB通路蛋白及緊密連接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥 選取8周齡的MKR小鼠，高脂喂養(yǎng)4周，隨機(jī)分為3組：模型組(Model)、左歸復(fù)方高劑量組(ZGFFG)、左歸復(fù)方低劑量組(ZGFFD)，每組8只。選取8只同齡FVB小鼠作為空白組(Control)。中藥低、高劑量組分別給予左歸復(fù)方煎液14 g/kg、56 g/kg灌胃，模型組和空白組給予等體積蒸餾水灌胃，每日給藥1次，連續(xù)治療4周。

1.2.2空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及胰島素(insulin,INS)的測(cè)定 給藥4周后禁食12 h，尾靜脈取血進(jìn)行FBG檢測(cè)；眼球采血取血清，采用ELISA方法檢測(cè)INS。根據(jù)測(cè)定值計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，公式如下：HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3標(biāo)本采集 給藥4周后禁食12 h，進(jìn)行眼球采血。隨后立即取下腸道結(jié)腸組織，將結(jié)腸組織分為3份，分別放入4%的多聚甲醛、Trizol于-80℃保存。

1.2.4口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT) 禁食12 h后，依據(jù)小鼠不同體重，按照 2 g/kg 的葡萄糖總量，將50%的葡萄糖用蒸餾水稀釋成20%的葡萄糖后進(jìn)行灌胃，分別在灌胃前及灌胃后30、60、90、120 min尾靜脈取血進(jìn)行血糖檢測(cè)。

1.2.5結(jié)腸HE染色 結(jié)腸組織用4%的多聚甲醛室溫固定4 h，再進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，隨后制作2 μm的石蠟切片進(jìn)行HE染色。

1.2.6ELISA 根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS的血清含量。

1.2.7RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá) 結(jié)腸組織勻漿后，Trizol提取組織總RNA。引物由上海生工合成引物，見(jiàn)表1。反應(yīng)條件95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。

表1 檢測(cè)基因的引物序列

Tab.1 Primer sequences

Primer nameDirectionSequenceTLR-4F5′-AGACACTTTATTCAGAGCCGTTG-3′R5′-AAGGCGATACAATTCCACC-3′N(xiāo)F-κBF5′-TAGCCAGCGAATCCAGACCAACA-3′R5′-TGGGTCCCGCACTGTCACCT-3′Claudin-1F5′-AGCCCACATTTTGAAGCGTA-3′R5′-CCAAAGTGCAAAGACCGTCCA-3′OccludinF5′-ATCGTGGCTTTTGCTTTAATCATC-3′R5′-GGGCTGTTCATCATAAATGTGTT-3′ZO-1F5′-ACCGAAACCTGTGTATGCTC-3′R5′-ATCATTTCCACCAGCTAGTCG-3′β-actinF5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′R5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′

1.2.8Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取用蛋白裂解液提取結(jié)腸組織總蛋白，根據(jù)蛋白定量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行調(diào)平后，配置10%、15%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至NC膜。使用5%脫脂奶粉室溫封閉放置 60 min，4℃過(guò)夜。隨后加入一抗(TLR4,1∶3 000;NF-κB,1∶2 000;Claudin-1,1∶1 000;ZO-1,1∶1 000;Occludin,1∶1 000)，室溫孵育90 min，PBST洗3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗于室溫下孵育90 min，充分漂洗后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，顯影沖洗。

2 結(jié)果

2.1左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠血糖和胰島素敏感性的影響 如圖1所示，模型組與空白組比較，F(xiàn)BG和INS水平顯著升高(P<0.001)，提示存在糖耐量異常；而經(jīng)過(guò)左歸復(fù)方干預(yù)后，左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組均能顯著降低了FBG及INS水平(P<0.01，P<0.001)，且左歸復(fù)方高劑量組降低INS水平作用優(yōu)于低劑量組(P<0.001)。同時(shí)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR，結(jié)果顯示模型組HOMA-IR顯著高于空白組(P<0.001)；與模型組相比，左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR降低顯著(P<0.001)，但兩組之間無(wú)差異，提示左歸復(fù)方能有效改善糖代謝和胰島素抵抗。

2.2左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠OGTT的影響 各組小鼠給予葡萄糖負(fù)荷后，均在30 min后血糖濃度達(dá)到峰值。從圖2中可以看出模型組各階段血糖值均高于空白組及左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組，且糖耐量曲線(xiàn)下面積(AUS)顯著高于正常組(P<0.001)，而左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組均能明顯降低AUS(P<0.01，P<0.001)。

圖1 左歸復(fù)方對(duì)血糖和胰島素敏感性的影響Fig.1 Effect of ZGFF on blood glucose and insulin sensitivity of MKR ratsNote: ###.P PP P

2.3左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠結(jié)腸病理形態(tài)的影響 如圖3所示，空白組結(jié)腸上皮細(xì)胞連接緊密，黏膜完整，無(wú)充血、水腫、剝脫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；腸道上皮絨毛排列整齊且致密，腸腺形態(tài)正常。模型組可見(jiàn)結(jié)腸上皮細(xì)胞黏膜完整性受損，有充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛稀疏變短，間隙變寬。經(jīng)左歸復(fù)方治療后，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，上皮細(xì)胞連接緊密，未見(jiàn)充血和水腫，炎性細(xì)胞顯著減少，腸腺比模型組排列規(guī)則整齊。

2.4左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠炎癥和血清LPS水平的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量和血清中LPS含量明顯增多(P<0.001)；與模型組比較，左歸復(fù)方高劑量組顯著降低了血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS的含量(P<0.01，P<0.001)；左歸低劑量組能明顯降低IL-1β、IL-6和LPS的含量(P<0.05)，但對(duì)TNF-α含量降低不顯著。左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組之間無(wú)顯著差異。

2.5左歸復(fù)方對(duì)TLR4/NF-κB通路mRNA表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步探究左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠腸道慢性低度炎癥的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了TLR4/NF-κB信號(hào)通路mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.001)；與模型組相比，左歸復(fù)方給藥組明顯下調(diào)TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.001，圖5)，并且從圖中可以看出，左歸復(fù)方高劑量組要優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

圖2 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠OGTT的影響Fig.2 Effect of ZGFF on OGTT of MKR ratsNote: ###.P PP

圖3 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠結(jié)腸病理形態(tài)的影響(HE染色，×100，×200)Fig.3 Effect of ZGFF on colonic tissues of MKR rats(HE staining,×100,×200)Note: HE staining was performed for phathology injury of rats.

圖4 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠炎癥和血清LPS水平的影響Fig.4 Effect of ZGFF on inflammation and LPS level of MKR ratsNote: ###.P PP PP=0.001 versus model group.

圖5 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠TLR4/NF-κB通路的影響Fig.5 Effects of ZGFF on TLR4/NF-κB signal pathway of MKR ratsNote: ###.P PP P

2.6左歸復(fù)方對(duì)TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)的影響 同時(shí)我們檢測(cè)了TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。如圖6所示，與空白組相比，模型組中TLR4、NF-κB蛋白含量顯著升高(P<0.001)；經(jīng)過(guò)左歸復(fù)方干預(yù)后，左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組TLR4、NF-κB蛋白含量與模型組相比均顯著下調(diào)(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。左歸復(fù)方高劑量組TLR4蛋白含量下調(diào)較低劑量組顯著(P<0.01)，但NF-κB蛋白含量?jī)山M比較無(wú)顯著差異。

圖6 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠腸道TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of ZGFF on protein expression of TLR4/NF-κB of MKR rats in colon tissueNote: ###.P PP PP

圖7 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠腸道緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effects of ZGFF on mRNA of Occludin,Claudin-1,ZO-1 of MKR rats in colon tissueNote: ###.P PP

2.7左歸復(fù)方對(duì)腸道緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響 為了探究左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠的組織慢性低度炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們檢測(cè)了左歸復(fù)方對(duì)腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)的影響。如圖7所示，與空白組相比，模型組Occludin、Claudin-1、ZO-1 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.001)；經(jīng)過(guò)左歸復(fù)方治療，與模型組相比，左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組Occludin、ZO-1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05,P<0.01)；左歸復(fù)方雖能一定程度上調(diào)Claudin-1 mRNA表達(dá)，但無(wú)顯著性差異。左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組兩組相比也無(wú)顯著差異。

圖8 左歸復(fù)方對(duì)MKR鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of ZGFF on protein expression of Occludin,Claudin-1,ZO-1 of MKR rats in colon tissueNote: ##.P PP P

2.8左歸復(fù)方對(duì)腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響 如圖8所示，模型組中Occludin、Claudin-1、ZO-1 蛋白含量顯著下降，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01,圖8)；與模型組相比，左歸復(fù)方高劑量組和低劑量組能明顯上調(diào)Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.001)，但左歸復(fù)方低劑量組的ZO-1 的蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異；另外，左歸復(fù)方高劑量組的Claudin-1 蛋白水平與模型組相比，不僅沒(méi)有上升，反而一定程度上有所下調(diào)，且低劑量組與模型組相比無(wú)顯著性差異。

3 討論

全身低度慢性炎癥和代謝性?xún)?nèi)毒素血癥是T2DM發(fā)生發(fā)展的重要原因。腸道革蘭陰性菌產(chǎn)生的LPS，可從破壞的腸道黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)到血液，導(dǎo)致代謝性?xún)?nèi)毒素血癥的發(fā)生[14]。特別是高脂肪飲食可導(dǎo)致腸道緊密連接蛋白(如Occludin和ZO-1)水平降低，腸道通透性增加[14]。這些變化使血漿中LPS水平升高，循環(huán)中的LPS在全身細(xì)胞中結(jié)合并激活TLR4，引起損害性細(xì)胞因子分泌增多，最終導(dǎo)致胰島素抵抗[15]。同時(shí)產(chǎn)生的炎癥因子又破壞腸道黏膜屏障，導(dǎo)致更多的促炎細(xì)胞到達(dá)腸道固有層，造成持續(xù)的腸道低度慢性炎癥，進(jìn)一步加重機(jī)體胰島素抵抗[4,9]。

T2DM屬中醫(yī)“消渴”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，T2DM的根本病機(jī)為脾失健運(yùn)、精不正化、肝腎陰虧。脾氣虧虛則運(yùn)化無(wú)力，導(dǎo)致脈中精微物質(zhì)(血糖)不能正常輸布利用，留于脈中，血糖升高。另一方面，衛(wèi)氣生于水谷，源于脾胃，可防外邪，循行于腸道，成為防御外邪的第一道屏障，如腸道黏膜屏障功能穩(wěn)健能防止有害代謝產(chǎn)物透過(guò)黏膜屏障而引發(fā)疾病的發(fā)生。但如果脾氣虧虛，則衛(wèi)氣生化無(wú)源、防邪無(wú)力、無(wú)力驅(qū)邪外出，將會(huì)導(dǎo)致外邪(有害代謝產(chǎn)物)入侵。左歸復(fù)方是治療T2DM的臨床驗(yàn)方，以補(bǔ)脾益氣、滋陰降火為主，方中重用黃芪補(bǔ)益脾氣，又以生地滋補(bǔ)腎陰，輔以山藥健脾，充分體現(xiàn)了從脾論治的中醫(yī)治則理論，但其作用機(jī)制尚未明確。

本研究結(jié)果表明，左歸復(fù)方能明顯改善T2DM鼠胰島素抵抗，降低血液中LPS和炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度，以及下調(diào)腸道組織的TLR4/NF-κB基因和蛋白表達(dá)水平，提示左歸復(fù)方可能通過(guò)減輕腸道及全身慢性低度炎癥從而改善胰島素抵抗。另一方面，實(shí)驗(yàn)研究表明，左歸復(fù)方還能修復(fù)腸道黏膜，上調(diào)腸道緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的基因和蛋白表達(dá)水平，維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)，為探討T2DM“脾為本虛”病機(jī)理論及左歸復(fù)方治療機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，左歸復(fù)方可降低T2DM鼠血糖水平、改善胰島素抵抗，并能通過(guò)抑制炎癥因子、LPS從而減輕腸道持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)和內(nèi)毒素血癥。由此可知，左歸復(fù)方以脾為本的治則與益氣健脾的治療機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路激活和上調(diào)腸道緊密連接蛋白表達(dá)密切相關(guān)。