MAIT在帶狀皰疹中的免疫作用研究

黃 倩 王玉芝 黃 欣 李欣怡 李成文

(西南醫科大學基礎醫學院,瀘州 646000)

帶狀皰疹(herpes zoster，HZ)是一種機體免疫力降低時，體內水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)重新被激活而導致的疾病，10%～30%的總人群在其一生中會發生HZ，而大于85歲的人群頻率會增加到50%，在老年人或體弱人群中常見，其特征是單側疼痛和皮疹[1,2]。HZ的常見并發癥是一種嚴重的持續性HZ后神經痛(postherpetic neuralgia,PHN)。HZ常用的藥物治療包括抗病毒、止痛、營養神經、提高免疫力、局部外用藥、物理治療、皮質類固醇激素等。抗病毒藥物主要是阿昔洛韋、更昔洛韋、膦甲酸鈉等。胸腺肽、轉移因子、B族維生素等可提高免疫力，糖皮質激素在HZ的早期能緩解疼痛，但有嚴格的禁忌癥。音頻電療法、光療法可促進皮損的恢復[3]。VZV特異性抗體不會隨著年齡的增長而減少，表明單獨的抗體不足以防止VZV再激活[4]。隨著年齡增長觀察到VZV再激活主要歸因于T細胞數量減少和功能降低[5]。

黏膜相關恒定T細胞(mucosal associated invari-ant T cells，MAIT)是非多態性(nonpolymorphic)MHCⅠb型主要組織相容性復合物相關蛋白(major histocomp-atibility complex classⅠb molecule，MHC classⅠ-related protein 1，MR1)限制的T淋巴細胞亞群[6]，分為三種亞型，即CD4+、CD8+(主要是CD8αα+)和CD4-CD8-細胞。MAIT與經典的T細胞不同，具有多樣性有限的αβ T細胞受體(TCR)，由恒定的TCRα鏈(在人類，恒定Vα7.2與 Jα33、Jα12或Jα20配對)與變化有限的TCRβ鏈的Vβ13(TRBV6)和Vβ2(TRBV20)組成[7]。MAIT在腸、肝和肺等部位富集，在血液循環中也很豐富，健康人的外周血中MAIT占T淋巴細胞的1%～10%[8]。以可溶性形式表達并用5-OP-RU 抗原重新折疊的人和小鼠四聚體MR1分子能夠檢測MAIT，由于這些試劑沒有被商業化，通常用Vα7.2+CD161+細胞作為MAIT的替代標記，可以檢測大部分四聚體陽性的MAIT[9]。因此MAIT被認為是CD3+CD161+Vα7.2+T細胞，表現出與iNKT細胞相似的固有免疫功能。與iNKT細胞一樣，它們都表達恒定的TCRα鏈識別被MR1呈遞的抗原，通常是維生素B類代謝產物，此外，MAIT也可經TCR非依賴方式參與免疫應答[10]。MAIT活化后主要產生IFN-γ、TNF-α、IL-17等細胞因子，也產生GZB、穿孔素等對受病毒感染的靶細胞進行殺傷清除[11]。研究報道，MAIT可發揮致病和治病作用[12]，但目前關于MAIT對HZ的免疫作用研究甚少，本研究通過檢測HZ患者外周血中MAIT的頻率和功能，分析MAIT與HZ的關系，以便為判斷HZ的病情和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象及分組 選擇2018年11月25日到2019年10月30日期間就診于西南醫科大學附屬醫院的25例HZ治療前患者作為治療前組，在入院第二天清晨被采集外周血。12例HZ患者口服鹽酸伐昔洛韋，輸注更昔洛韋及局部對癥治療5 d作為治療后組，再次采集外周血。選擇20例健康志愿者作為健康對照組。

1.1.2抗體和試劑 APC-CY7-抗CD3、PE-抗CD161、AF647-抗PD-1、PE-CY7-抗CD69、PE-CY7-抗IFN-γ、APC-抗GZB、BB515-抗TIM-3、AF647-抗IL-17A、Human BD Fc Block、Leukocyte Activation Cocktail、10×BD Perm/Wash buffer和固定破膜劑均購自BD Biosciences；percp-cy5.5-抗TCR Vα7.2(美國BioLegend)；1640培養基(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；Ficoll-plaque plus(GE healthcare)。

1.2方法

1.2.1外周血PBMC的分離 用EDTA抗凝管采集靜脈血5 ml，加入等體積PBS混勻后經Ficoll plus密度梯度離心獲取PBMC，-80℃凍存備用。

1.2.2流式細胞術檢測MAIT 復蘇凍存的PBMC，加入3 ml含10%FBS的1640培養基混勻，接種到12孔板的3孔中，每孔細胞1×106個，在第一、二孔中均加入2 μl Leukocyte Activation Cocktail，混勻后于37℃、5%CO2中孵育6 h。分別收集3孔細胞，洗滌后每管加入1 μl FC block，室溫孵育10 min，每管加入APC-CY7-抗CD3、percp-cy5.5-抗TCR Vα7.2、PE-抗CD161，第二管加入BB515-抗TIM-3，第三管再加入AF647-抗PD-1、PE-CY7-抗CD69，4℃避光孵育30 min，洗滌后第一管和第二管均加入250 μl固定破膜劑，4℃避光孵育20 min，洗滌后第一管加入PE-CY7-抗IFN-γ、APC-抗GZB，第二管加入AF647-抗IL-17A。4℃避光孵育30 min，Wash buffer洗兩次棄上清，重懸后上機檢測。

2 結果

2.1人口統計學特征 研究共納入HZ患者25例，其中治療5 d后的患者12例，與患者年齡相匹配的同期健康志愿者20例。患者的臨床和流行病學特征見表1。3組中年齡相比差異無統計學意義，四種細胞的均值均在正常范圍內。

CharacteristicGroupsControl group(n=20)HZ patients before treatment (n=25)HZ patients after treatment (n=12)Age49.85±16.647.24±14.4150.17±8.81Female10113Male10149Cell countsLeukocyte (109 L-1)6.51±1.205.39±1.28n/aNeutrophil (109 L-1)3.99±1.103.00±1.00n/aMonocyte (109 L-1)1.20±0.750.53±0.16n/aLymphocyte (109 L-1)1.14±0.991.71±0.53n/a

2.2MAIT在HZ患者外周血中頻率的變化 實驗通過流式細胞儀確定了外周血中CD3+TCRVa7.2+CD161+細胞為MAIT。HZ治療前患者組MAIT頻率比健康對照組明顯降低(P<0.01，圖1B)。患者在接受抗病毒治療5 d后，外周血MAIT頻率比治療前增加(P<0.05，圖1B)，與健康對照組比較MAIT水平稍低，差異無統計學意義(圖1B)。

圖1 健康對照組與HZ患者治療前和治療后MAIT頻率Fig.1 Frequency of MAIT of healthy controls,HZ patients of before treatment and HZ patients of after treatmentNote:*.P P

圖2 健康對照組與HZ患者治療前和治療后MAIT CD69、PD-1和TIM-3的頻率Fig.2 Frequency of CD69,PD-1 and TIM-3 in MAIT of healthy controls,HZ patients of before treatment and HZ patients of after treatmentNote:A.Representative flow cytometric plots of CD69,PD-1 and TIM-3 expression in MAIT in peripheral blood of three groups；B.Comparison of MAIT in peripheral blood of three groups.*.P PP

2.3MAIT活化、分泌細胞因子和功能耗竭的變化 CD69是MAIT的活化標志，結果顯示與健康對照組比較，HZ治療前患者組外周血MAIT的CD69表達顯著上調(P<0.01，圖2B)，也比治療后患者組高(P<0.05，圖2B)；PD-1和TIM-3是免疫衰竭標志物，HZ治療前患者組外周血中MAIT表達的PD-1比健康對照組顯著降低(P<0.05，圖2B)，比治療后患者組升高(P<0.05，圖2B)，治療后患者組PD-1比健康對照組降低(P<0.001，圖2B)；而TIM-3的表達比健康對照組高(P<0.01，圖2B)，也高于治療后患者組(P<0.05，圖2B)。分泌的GZB增高(P<0.001，圖3B)，也高于治療后患者組(P<0.01，圖3B)，但分泌的IFN-γ較健康對照組低(P<0.05，圖3B)，也低于治療后患者組(P<0.001，圖3B)。IL-17A在3組中表達均無統計學差異(圖3B)。

2.4不同病情程度的HZ患者外周血MAIT的頻率、表面分子及細胞因子比較 實驗對患者的病情分為輕度和中重度[13]。研究發現，與健康對照組比較，輕度組患者外周血MAIT頻率無統計學差異，中重度組顯著下降(P<0.01，圖4A)；中重度組MAIT表達的CD69高于健康對照組和HZ輕度組(P<0.001，圖4B)，分泌的GZB顯著高于健康對照組(P<0.001，圖4E)，也高于輕度組患者(P<0.05，圖4E)；健康對照組的IFN-γ比輕度和中重度組高(P<0.05，圖4F)，TIM-3則低(P<0.01，圖4D)。

圖4 健康對照組和HZ患者不同病情程度中MAIT、表面標志物和細胞內胞因子的頻率Fig.4 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls and patients with different degrees of disease in HZNote:*.P PP

3 討論

MAIT在不同的病毒感染中產生的免疫應答有差異[14]，其在HZ中的作用尚不清楚。本實驗研究了MAIT在HZ中的作用，發現HZ治療前患者組外周血中MAIT的水平與健康對照組相比嚴重下降，活化水平隨病情程度的增加而上升，參與機體抗病毒免疫作用。

文獻報道，MAIT產生的IFN-γ主要受NFAT1轉錄因子調控，活化的NFAT1向核內易位，與DNA相關位點結合分泌IFN-γ[15]。在系統性紅斑狼瘡患者外周血中也發現MAIT中IFN-γ產生受損是由于Ca2+/鈣調神經磷酸酶/NFAT1信號傳導途徑的內在缺陷所致。本研究中IFN-γ的減少可能是由于其中一種或兩種機制導致。TIM-3在病毒感染中引起T細胞死亡，Gal-9參與TIM-3誘導體外細胞死亡，體外實驗也證實Gal-9劑量依賴性損傷IFN-γ的產生[16]，這可能也是本實驗中MAIT分泌的IFN-γ減少的原因之一。

PD-1由多種促炎因子(LPS、GM-CSF、VEGF)和細胞因子(IFN-γ、TNF-α)誘生[17]。因此可以解釋本研究中治療前IFN-γ的分泌減少可能導致了PD-1的表達下降，逃脫了免疫抑制作用[18]，表現為活化增強，CD69表達升高。而治療后IFN-γ升高，TIM-3降低，可能是患者機體免疫功能逐漸恢復正常，不需要MAIT大量活化參與抗病毒。這些變化說明MAIT參與了機體的抗病毒。T細胞介導的細胞免疫在成功清除和控制VZV感染中至關重要[19]。田瓊等[20]研究報道，HZ患者的臨床嚴重程度與淋巴細胞之間存在關聯。本研究顯示，病情越重，MAIT頻率越低，活化程度越高，表達TIM-3增多，但是分泌細胞因子IFN-γ降低，這與文獻高表達TIM-3的細胞分泌IFN-γ減少，殺傷功能減弱一致[21]。

VZV分離株表現出很少的序列變異性，與毒力無關，表明宿主免疫是疾病嚴重程度的主要決定因素，而不是病毒株之間的差異[22]。參照文獻[23]中對外周血T細胞分類的方法，GZB可劃分為耗竭型細胞因子，IFN-γ劃分為活化型細胞因子。研究顯示MAIT在HZ治療前患者組外周血中存在功能損傷，顯示了一種異常表型，即衰竭細胞因子升高，活化細胞因子降低。GZB促進IL-6、IL-18等促炎性細胞因子的激活，導致炎癥和傷口愈合的延遲，其頻率與病變嚴重程度也呈正相關[24,25]。有研究表明，活化的CD8+T細胞產生的GZB可能在不同的疾病環境中功能不同，可能與疾病的嚴重程度有關聯，也有研究表示，CD8+T細胞主要產生GZB ，但是不能控制或降低患者惡性瘧原蟲瘧疾的寄生蟲血癥[26,27]。研究顯示，PD-1不僅在Friend病毒(FV)感染的早期階段調節效應細胞的擴增，而且還調節它們分化，下調產生GZB的細胞毒性效應因子。細胞毒性CD8+T細胞(CTL)可有效控制急性病毒感染，但在發展為慢性感染時可能會功能耗竭。在人類免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒感染或FV感染中，病毒特異性CD8+T細胞就功能耗竭。CTL的功能障礙與抑制性檢查點受體的表達也有關，并且是這些受體與配體結合的結果[28]。因此，本實驗中MAIT產生耗竭型GZB增多除了殺病毒感染細胞的能力下降而使病情加重外，可能也與PD-1的表達導致GZB的功能耗竭有關。根據上述討論，可以初步推測HZ患者的MAIT受VZV作用后，功能受損，分泌IFN-γ降低，從而使PD-1表達下降，有利于釋放GZB，導致MAIT耗竭，使得HZ病情加重或延緩。這種推測還需要后續系列實驗進一步證實。

本研究發現，治療后MAIT頻率上升，CD69、PD-1下降，GZB分泌下降，但IFN-γ上升，可能是TIM-3的降低導致。因此，檢測HZ患者MAIT頻率和功能有助于判斷病情和評估治療效果。