STK17A基因經TGF-β/SMAD信號通路調控宮頸癌細胞增殖凋亡及侵襲的機制研究

劉海霞 宋 梅 戴淑鳳

(青島市第三人民醫院,青島 266041)

宮頸癌是當前世界范圍內女性發病率第二的腫瘤，持續感染高危型人類乳頭瘤病毒是引起該病的主要原因[1,2]。巴氏涂片以及液基薄層細胞學檢查(thinprep cytology test,TCT)是近年來宮頸癌篩查的一種低成本且操作簡便的篩查手段[3]。盡管宮頸癌診斷和治療手段不斷改進，但是晚期宮頸癌患者的5年生存率仍然很低，因此，對宮頸癌進展的潛在分子機制進行研究并且提供有效的治療方法十分重要。絲氨酸/蘇氨酸激酶17A (serine/threonine kinase 17A,STK17A)是死亡相關蛋白家族(death-associatedprotein，DAP)中的一員且DAP家族中成員被證實在多種癌癥中的表達受到限制，同時與多個細胞凋亡和自噬相關通路有關[4-6]。近年來關于STK17A在膠質母瘤、大腸癌、睪丸癌等癌癥進展中的研究也被逐漸發現[7-9]。但是關于其在宮頸癌中的作用尚不明確。轉化生長因子β (transforming growth factor beta,TGF-β)/SMAD通路是癌變過程中的重要調節通路，研究證實其在宮頸鱗癌中被激活[10]。在前人研究基礎上，本研究旨在明確STK17A在宮頸癌中的價值并探討其具體作用途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 pcDNA3.1(+)質粒購自Invitrogen；基因組DNA提取試劑盒、Lipofectamine 3000試劑盒、總RNA提取試劑盒、TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒、CCK-8試劑盒購自賽默飛世爾；人子宮頸上皮細胞及Hela、SiHa和C-33A宮頸鱗癌細胞系購自拜力生物；TGF-β/SMAD通路抑制劑SB-431542購自美國Selleck；蘇木素染液、伊紅染液、DAB染液購自北京索萊寶；Western blot中所有抗體購自ABCAM；RIPA細胞裂解液；Matrigel膠、Transwell小室購自上海復申生物科技有限公司；Anexin-V-FITC染液、PI染液購自銳賽生物；BD FACSCALIBUR 流式細胞儀德國貝克曼；倒置顯微鏡購自奧林巴斯；X960全自動PCR儀購自力康生物醫療科技有限公司；SorvallTMLegendTM臺式離心機購自賽默飛世爾。STK17A序列及shRNA序列交由華大基因合成。

1.1.2組織來源 收集我院2012年至2017年43例宮頸癌患者宮頸癌組織及癌旁組織。患者年齡23～67歲，平均年齡42.2歲。鱗狀細胞癌32例，腺癌11例。根據FIGO分期，癌組織中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ 5例。所有患者均在知情同意書上簽字并且組織實驗均通過我院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1STK17A沉默及過表達重組質粒構建 利用NCBI上人的STK17A mRNA全長(NM_004760.3)在BLOCK-iTTMRNAi Designer網站在線設計STK17A的shRNA序列(5′-CACCGGGTGACATTAAGATTGTTGACGAATCAACAATCTTAATGTC-ACCC-3′)。參照GenBank中的STK17A基因序列，采用Primer 5.0設計一對特異引物(5′-TCTGAGTCGGCTGTTGATTTC-3′，3′-GGGGTGCTTTAGACATTCTTCA-5′)并分別在上下游引物加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。pcDNA3.1(+)質粒經EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后與目的基因片段連接，隨后轉化至DH 5α大腸桿菌進行克隆。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用DNA大量抽提試劑盒提取大腸桿菌中重組載體，保存至-80℃備用。

1.2.2細胞分組及轉染 人子宮頸上皮細胞培養于完全培養基中。Hela、SiHa、C-33A宮頸鱗癌細胞系培養于含10%FBS及1%P/S的MEM培養基中。待細胞達到80%匯合度時按1∶2～1∶6進行傳代和培養。

Western blot篩選STK17A蛋白表達最低的細胞系用于后續實驗并分組：陰性對照組(轉染含有無關序列的重組質粒)、基因沉默組(轉染含有STK17A shRNA的重組質粒)、基因過表達組(轉染含有STK17A 片段的重組質粒)、通路抑制劑組(TGF-β/SMAD通路特異性抑制劑處理宮頸癌細胞)、聯合組(TGF-β/SMAD通路抑制聯合STK17A過表達處理細胞)。轉染方式：傳代后取對數期細胞用于轉染。調整細胞密度后分別將50 μl Opti-MEM與1.5 μl Lipofectamine 3000以及1 μg DNA(濃度為2 μg/μl)相混合作為A液和B液，之后將A液和B液按照1∶1比例混勻并置于室溫下孵育。隨后添加DNA-脂質體復合物，培養24～48 h后更換培養基。抑制劑處理方法：SB-431542溶于適量DMSO中，終濃度為100 μmol/L。血清饑餓處理細胞24 h后加入SB-431542，處理48 h。

1.2.3HE染色 將癌組織及癌旁組織進行石蠟包埋后切片。溫箱烤干1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗，蘇木素浸染切片8～10 min，水洗1～2 min，1%鹽酸分化30 s，流水洗滌至天藍色。依紅染液浸染切片2～3 min，水洗1～2 min。梯度酒精脫水2次，脫水后的切片移入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分別透明3～5 min和5～10 min，中性樹膠固封。

1.2.4免疫組化檢測 將癌組織及癌旁組織進行石蠟包埋后切片。溫箱烤干1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。隨后經雙氧水及蒸餾水洗滌，每次1 min。 0.01 mol/L枸緣酸緩沖液進行微波抗原修復。5% BSA室溫封閉20 min，滴加一抗和二抗，分別于37℃條件下孵育，PBS沖洗。滴加適量SABC，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染2 min，自來水沖洗。梯度乙醇脫水后，中性樹膠固封。對組織染色強度(SI)及陽性細胞率(PP)進行評分。SI分為4級：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。PP分為5級：0分為無陽性細胞<5%，1分為陽性細胞5%～25%，2級為25%～50%，3級為51%～75%，4級為>75%。綜合評分為SI與PP乘積，0為陰性，1為弱陽性(+)，2記為中陽性(++)，大于3記為強陽性(+++)[11]。借助Image J軟件對免疫組化結果進行半定量分析，計算癌組織和癌旁組織中STK17A的陽性表達率。

1.2.5qRT-PCR 按Trizol試劑說明書提取宮頸癌細胞系中總RNA。DEPC處理的超純水溶解RNA，使用ND-1000測量260 nm和280 nm下吸光值，鑒定RNA的質量和濃度。利用TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒一步完成RT-PCR合成及Q-PCR。反應體系和反應條件均依據試劑盒說明書進行。使用實時熒光定量PCR儀進行擴增，相對表達水平以GAPDH為內參，引物序列由華大基因合成見表1。采用溶解曲線評價PCR結果的可靠性，取CT值 (擴增動力曲線拐點)，ΔCt=CT (目的基因)-CT (GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt (模型組)-ΔCt(正常組)。

1.2.6Western blot 棄去各組細胞培養液，PBS沖洗，加入200 μl含PMSF的RIPA裂解液。勻漿、裂解后離心。去離子水調整蛋白濃度，隨后行SDS-PAGE凝膠電泳并轉至PVDF膜上。含5% BSA的TBST在搖床上室溫封閉1 h。加入一抗兔抗大鼠STK17A、p-SMAD3、N-cadherin、E-cadherin和TIMP-3多克隆抗體，以GAPDH作為內參。轉印面朝上，置于4℃冰箱振蕩過夜。次日，用TBST漂洗。同法加入稀釋好的山羊抗兔IgG作為二抗，4℃孵育4～6 h，TBST洗膜。取化學發光試劑A液與B液按1∶1混勻后，均勻滴加在PVDF膜上，顯影液顯影。所有蛋白免疫印跡的條帶進行相對光密度分析，以目標條帶與內參照條帶的灰度值之比作為蛋白質的相對表達量。

1.2.7CCK-8測定細胞活力 測定各組宮頸癌細胞濃度，加一定量細胞懸液至96孔板中并調整至細胞濃度為105孔-1并設置對照。于37℃，5%CO2下培養過夜。隨后每孔加入10 μl CCK-8溶液。隨后測定0 h、24 h、48 h下的吸光值(450 nm)。

1.2.8細胞劃痕實驗 各組細胞用96孔板接種前先用marker筆在12孔板背面畫橫線標記。0.25%胰酶消化細胞2 min后接入96孔板。細胞鋪滿板底后，1 ml槍頭垂直于孔板進行劃痕，盡量保證各劃痕寬度一致。吸去細胞培養液，PBS洗滌3次，每次5 min。隨后加入無血清MEM培養基，拍照記錄。將96孔板放入培養箱培養，48 h后取出拍照。細胞遷移率=(0 h兩端細胞距離-48 h兩端細胞距離)/0 h兩端細胞距離×100%。

1.2.9Transwell細胞侵襲實驗 按1∶10用預冷無血清的MEM培養基稀釋Matrigel膠，吸取充分混勻的Matrigel，每上室加入100 μl稀釋后的Matrigel，室溫放置2 h；使用前加入200 μl 無血清1640培養基沖洗，將上述各組轉染24 h后的宮頸癌細胞用無血清DMEM培養基重懸，計數并稀釋至3×105個/ml，取100 μl 加入Transwell上室中，同時往下室中加入600 μl 10%血清的DMEM培養基，按照Transwell小室說明書操作，用結晶紫染色，光鏡下隨機選取三個視野并計數跨膜的細胞數，計算細胞侵襲率。侵襲率=穿過基質膠的細胞數/總細胞數×100%。

表1 qRT-PCR引物

Tab.1 qRT-PCR primer

GeneUpstream primer(5′-3′)Downstream primer(5′-3′)TGF-β1CTGCAAGACTATCGACATGGAATGGTGGAAACCCACAACGSMAD3AAACCAGGCTGGCTAAACAAGTGGCAACAGCAGCAGTGAAGGTGE-cadherinCATAAACGAGGTTCTGTCTTCAGGATAATAGTCGGGAGGTGN-cadherinAAGACAATGACTACGTGTAGGATAGCCGGACTAGGGATGCTIMP3CATGTGCAGTACATCCATACGGCATCATAGACGCGACCTGTCAGAPDHTACATGGCTGGGGTGTTGAAAAGAGAGGCATCCTCACCCT

1.2.10Annexin V-FITC/PI雙染檢測宮頸癌細胞凋亡 處理48 h后各組宮頸癌細胞經PBS洗滌細胞1次，隨后在2 000 g下離心5 min，棄上清，重懸細胞并調整其密度為4×105個/ml。加入500 μl結合緩沖液懸浮細胞，之后加入5 μl Anexin-V-FITC輕柔混勻后隨即加入5 μl PI染液混合均勻，冰育避光反應10～12 min。流式細胞儀在5 min內上機檢測，激發波長為488 nm，530 nm下檢測FITC和575 nm下檢測PI。

2 結果

2.1宮頸癌和癌旁組織病理情況觀察 HE染色結果顯示(圖1)：宮頸鱗癌呈巢團狀，細胞核深染大小不一，可見病理性核分裂像，核膜增厚，染色質豐富偶見核溝。組織排列紊亂，無極性。巢團中間可見角化，角化珠形成趨勢，間質減少僅見少許纖維組織及血管組織。而癌旁組織中細胞間隔明顯，且與黏膜下組織存在較為顯著的界限。

2.2宮頸癌和癌旁組織中STK17A陽性表達情況 免疫組化對癌癥及癌旁組織中STK17A進行定位與半定量。結果發現(圖2)：STK17A蛋白在胞漿和核內表達不均一。與癌旁組織相比陽性率為(72.88±9.21)%，癌癥組織中STK17A細胞陽性率為(3.12±1.18)%，其表達顯著下調(P<0.05)。

2.3STK17A蛋白在宮頸癌細胞系中的表達 Western blot檢測不同宮頸癌細胞株中STK17A表達情況(圖3)。與HCECs相比，其余宮頸癌細胞株中STK17A表達顯著下調(均P<0.05)。此外，Hela細胞系STK17A最低，因此選擇Hela細胞系進行后續實驗。

2.4各組Hela細胞中STK17A、TGF-β1、SMAD3、E-cadherin、N-cadherin和TIMP3表達 研究結果顯示(圖4)：Hela細胞經STK17A沉默或過表達處理后均有顯著效果(均P<0.05)。與陰性對照組相比，TGF-β1、SMAD3、N-cadherin mRNA及蛋白在基因沉默組中顯著上調，但E-cadherin和TIMP3表達在基因沉默組中被顯著抑制(均P<0.05)。相反，Hela細胞經STK17A過表達或抑制TGF-β/SMAD3通路后TGF-β1、SMAD3、N-cadherin 表達下調，但E-cadherin和TIMP3表達被顯著誘導(均P<0.05)。

圖2 宮頸癌及癌旁組織免疫組化染色結果Fig.2 Immunohistochemical staining results of cervical cancer tissue and adjacent tissue

圖3 不同細胞系中STK17A蛋白表達情況Fig.3 STK17A protein expression in different cell linesNote: A.Protein bands of STK17A in different cell lines;B.Quatification of STK17A protein in different cell lines.Compared with HCECs,*.P P

圖4 各組細胞中STK17A、TGF-β1、SMAD3、E-cadherin、N-cadherin和TIMP3 mRNA和蛋白表達情況Fig.4 mRNA and protein expression of STK17A,TGF-β1,SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 in each groupNote: A.mRNA expression of STK17A,TGF-β1,SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 in each group;B.Protein bands of STK17A,TGF-β1,p-SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 in each group;C.Quatification of STK17A,TGF-β1,p-SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 protein expression in each group.Compared with NC group,*.P P

2.5各組細胞活力檢測結果 CCK-8檢測各組細胞中黃色甲臜含量(生成的甲臜物數量與活細胞數量成正比)。結果顯示(圖5)：與陰性對照組24 h和48 h相比，STK17A shRNA轉染Hela細胞后能顯著增加其細胞活力(P<0.05)。相反，STK17A過表達或抑制TGF-β/SMAD3通路后Hela細胞活力被顯著抑制(均P<0.05)。同時，聯合組對Hela細胞抑制效果更加明顯(P<0.05)。

2.6各組細胞遷移和侵襲能力檢測結果 細胞劃痕和Transwell侵襲實驗評定各組細胞的侵襲轉移能力。結果顯示(圖6)：與陰性對照組相比，STK17A 沉默處理后Hela細胞侵襲轉移能力被顯著誘導(P<0.05)。相反，STK17A過表達或抑制TGF-β/SMAD3信號通路后Hela細胞株移行及跨Matrigel膠能力被明顯抑制(均P<0.05)。上述兩者聯合處理能更顯著地抑制Hela細胞侵襲轉移能力(P<0.05)。

圖5 各組細胞活力檢測結果Fig.5 Cell viability results in each groupNote: Compared with NC group,*.P P

圖6 各組細胞侵襲轉移能力檢測結果

Fig.6 Invasion and metastasis ability in each group

Note: A.Scratch healing results in each group at 0 h and 48 h;B.Crystal violet staining results in each group;C.Quatification of migration rate in each group;D.Quatification of invasion rate in each group.Compared with NC group,*.PP

圖7 各組細胞凋亡情況Fig.7 Cell apoptosis in each groupNote: A.Image output by flow cytometer;B.Quatification of cell apoptosis in each group.Compared with NC group,*.P P

2.7各組細胞凋亡情況檢測結果 Annexin V-FITC/PI雙染檢測各組細胞中早期與晚期凋亡細胞的比例。結果顯示(圖7)：與陰性對照組相比，STK17A 沉默處理后凋亡的Hela細胞凋亡明顯減少(P<0.05)。相反，STK17A過表達或抑制TGF-β/SMAD3信號通路能顯著誘導Hela細胞的凋亡(均P<0.05)。上述兩者聯合處理能更顯著地誘導Hela細胞的凋亡(P<0.05)。

3 討論

宮頸癌作為最常見的婦科腫瘤之一，當前其分子機制仍然缺乏足夠認識。STK17A(DRAK1) 經研究證實在凋亡調節中起重要作用，與腫瘤的進展密切相關[12，13]。在本研究中，我們重點探究了STK17A介導TGF-β/SMAD 信號通路對宮頸癌進展的調控作用，結果證實，STK17A過表達能夠抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲同時誘導其凋亡，在宮頸癌中起保護作用。

首先我們在研究中發現，STK17A在宮頸癌組織中表達顯著降低。STK17A主要位于細胞核內，通過蛋白激酶C的磷酸化轉移到細胞核外，有證據表明，STK17A與腫瘤抑制因子p53密切相關[12]。Short等[8]則發現STK17A基因在大腸癌中起保護作用，敲除該基因的表達能夠促進大腸癌的上皮間質轉化。也有證據表明，STK17A敲除會引起睪丸癌細胞對順鉑敏感性的降低[9]。此外，也有研究發現STK17A過表達能夠促進前列腺癌細胞的凋亡[14]。本研究進一步發現STK17A在宮頸癌中表達顯著降低，過表達STK17A能夠抑制宮頸癌的進展，且這一作用主要是通過TGF-β/SMAD信號通路實現的。TGF-β/SMAD通路是宮頸癌疾病發病過程中的重要通路之一，先前有研究證實，宮頸鱗癌患者癌組織中TGF-β1以及SMAD4表達升高，TGF-β/SMAD通路被激活[10]。本研究中qRT-PCR以及Western blot實驗檢測結果顯示，相對于陰性對照組，STK17A基因沉默組中TGF-β1、SMAD3表達升高，表明TGF-β/SMAD信號通路被激活。而過表達STK17A后，TGF-β/SMAD通路相關因子的表達被顯著抑制。此外，進一步過表達Hela細胞中STK17A或抑制TGF-β/SMAD信號通路后發現E-cadherin以及TIMP3的表達顯著升高，TGF-β1、SMAD3以及N-cadherin表達下調。經典鈣黏素家族的N-cadherin和E-cadherin被認為是上皮間質轉化的重要標記物，宮頸癌在內多種癌癥的進展程度與N-cadherin呈正相關，與E-cadherin呈負相關[15-17]。基質金屬蛋白酶家族(MMPs)經研究證實能夠對細胞外基質以及基底膜進行降解，促進腫瘤血管的形成[18]。而基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)能夠抑制MMPs的活性，抑制腫瘤的侵襲轉移[19，20]。給予以上研究結果，我們發現，STK17A過表達能夠抑制TGF-β/SMAD信號通路進而抑制宮頸癌的上皮間質轉化。

另外，CCK8、劃痕愈合以及細胞侵襲實驗證實，過表達STK17A或抑制TGF-β/SMAD信號通路能夠抑制Hela細胞活力，減少細胞遷移和侵襲。同時，細胞凋亡實驗顯示，沉默STK17A表達能夠顯著抑制Hela細胞的凋亡，而STK17A過表達及TGF-β/SMAD通路抑制劑則能夠誘導細胞凋亡且聯合處理效果更顯著。

綜上所述，本研究發現STK17A基因能夠作為宮頸癌調控的重要因子，STK17A基因過表達能夠顯著抑制TGF-β/SMAD信號通路的激活，從而抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲，促進細胞凋亡，在宮頸癌中起保護作用。我們的研究證實了STK17A在宮頸癌進展中的關鍵作用，提示其可作為宮頸癌治療的重要靶點，但今后仍需要更多的體內和體外實驗對其臨床價值進行進一步驗證。