過表達配對相關同源框1(PRRX1)通過調控Wnt/β-catenin通路抑制肝癌細胞體內致瘤性①

尹潤龍 尹東亮 盧沛林 李柱威 林志強

(東莞市人民醫院肝膽外科，東莞 523059)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內第五大常見癌癥和癌癥相關性死亡的第三大原因[1]。HCC約占原發性肝癌的90%，每年約有100萬人罹患HCC，且已成為全球性的健康問題[2]。盡管外科手術在過去的幾十年里取得了較大進步，但HCC患者仍面臨較高的術后復發或轉移的發生率[3]。因此，探討HCC發生發展的分子機制并尋求新的治療措施已成為國內外科研人員的熱議話題。越來越多的證據表明，癌癥的轉移是由處于浸潤期的原發性癌癥的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)特性所介導的[4,5]。而EMT被認為是由細胞因子[6]、轉化因子[7]和其他因素[8,9]所誘導的侵襲和轉移過程中的重要步驟。Wnt/β-catenin信號通路能夠調控原胚腸形成、心臟瓣膜形成甚至是癌癥發生過程中的EMT[10,11]。激活Wnt/β-catenin通路在胃癌的EMT過程中扮演重要作用[12]。配對相關同源框1(paired-related homoeobox 1，PRRX1)是最近被確認的一種新的EMT誘導物[13]。臨床研究表明，PRRX1的異常表達與多種實體腫瘤的不良預后相關；高表達的PRRX1與乳腺癌的低轉移率和良好預后顯著相關[14]，而在結直腸癌和胃癌中卻觀察到相反的關系[15，16]。此外，下調PRRX1的表達能通過獲取腫瘤干細胞樣屬性促進乳腺癌和HCC患者的不良預后[14,17]。因此，我們推測上調PRRX1的表達極有可能通過Wnt/β-catenin途徑參與肝癌細胞的生物學習性的調控。而本研究著重研究PRRX1過表達對肝癌細胞株SMMC-7721體內致瘤性的影響，并聯合Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939進行干預，探索Wnt/β-catenin信號通路在PRRX1介導的肝癌細胞致瘤性改變中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株SMMC-7721及HEK293細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫；RPMI1640培養基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自上海拜力生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939購自美國Med Chem Express公司；全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量測定試劑盒、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒及原位末端轉移酶標記技術(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Ki-67細胞增殖檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；超敏電化學發光(electrochemical lumines-cence，ECL)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；山羊抗人PRRX1多克隆抗體、兔抗人β-連環蛋白(β-catenin)多克隆抗體、兔抗人原癌基因(c-Myc)單克隆抗體以及兔抗人β-actin多克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的兔抗山羊IgG和HRP標記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；5～6周齡雌性BALB/c裸鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；光學顯微鏡為日本Olympus公司產品；輪轉式切片機為杭州艾普儀器設備有限公司產品；全自動數碼凝膠成像儀為上海天能科技有限公司產品。

1.2方法

1.2.1HEK293T細胞的培養及PRRX1重組慢病毒的制備 將HEK293T細胞置于含有100 ml/L FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2的環境下培養。本實驗中PRRX1重組慢病毒質粒pLV-PRRX1-IRES2-EGFP及空載重組質粒pLV-CON-IRES2-EGFP的構建及鑒定由上海吉凱基因化學技術有限公司完成；轉染前，取生長狀態良好的處于對數生長期的HEK293T細胞，提前2 d接種于培養皿中。取5 μg PRRX1重組慢病毒質粒、5 μg輔助質粒與相應體積的Opti-MEM混合均勻，總體積為2.5 ml，于室溫下孵育5 min，以空載重組質粒作陰性對照。取100 μl LipofectamineTM2000與2.4 ml Opti-MEM混合，室溫孵育5 min。再將兩種Opti-MEM混合液混合形成轉染復合物，共轉染HEK293T細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h后，收集細胞上清液，離心、過濾。上清液于4℃、25 000 r/min條件下離心2 h，所獲病毒分別命名為LV-PRRX1和LV-CON，-80℃保存備用。

1.2.2慢病毒滴度的測定 測定前一天，在24孔板中接種HEK293T細胞，每孔接種約5.0×104個細胞加入100 μl含10% FBS的RPMI1640培養液，于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。待細胞融合度達到30%左右時，吸棄24孔板中原有的培養液，將包裝后收集的病毒上清液進行梯度稀釋(10-1～10-7)后分別滴加到24孔板內，其中第一個EP管稀釋10-1，即10 μl 病毒液+90 μl含10% FBS的RPMI1640培養液；第二個EP管所得病毒原液為第一個EP管的1/10；依次類推，第七個EP管所得病毒原液為第六個EP管的1/10。將每個EP管中溶液混勻后滴加到24孔板中，于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h后加入100 μl含10%FBS的RPMI1640培養液，繼續培養。72 h后，在顯微鏡下觀察，計算最后兩個孔GFP熒光陽性細胞數，其中第六孔熒光細胞數目記為A，第七孔熒光細胞數目記為B。按下式計算病毒滴度：病毒滴度(TU/L)=(A+B×10)×103/2/第六孔的病毒液的含量(μl)×103。所得結果為：LV-PRRX1(病毒滴度)=2.5×1010U/L；LV-CON(病毒滴度)=4×1010U/L。

1.2.3SMMC-7721細胞培養及慢病毒感染 將SMMC-7721細胞置于含有100 ml/L FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃、5% CO2的環境下培養。取生長處于對數期的SMMC-7721細胞，制成單細胞懸液按每孔1.0×105個接種于24孔板中，待細胞融合達50%時，予以慢病毒LV-PRRX1和LV-CON均以感染復數(MOI)為100分別感染細胞(即兩種慢病毒用量均為1.0×105×MOI=107TU，按上述1.2.2病毒滴度測定結果換算成體積為：VLV-PRRX1=107U/2.5×1010U/L=0.4 ml；VLV-CON=107U/4×1010U/L=0.25 ml)，同時設置正常培養的細胞為空白對照組。病毒感染12 h后更換新鮮培養基繼續培養，2～3 d傳代1次。5 d后，在熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP的表達情況，并采用Western blot檢測各組細胞PRRX1的表達。

1.2.4裸鼠皮下移植瘤模型的構建及實驗分組 分別取對數生長期的對照組、LV-CON組和LV-PRRX1組SMMC-7721細胞制備成細胞懸液，調整細胞數至2×106個/ml，后注射于裸鼠右側背部皮下(劑量：0.2 ml/只)；其中對照組、LV-CON組每組10只，LV-PRRX1組20只。約1周后，待實驗裸鼠接種部位長出肉眼可見腫瘤(腫瘤直徑約0.5 cm)時，選取對照組和LV-CON組裸鼠各5只，LV-PRRX1組10只進行干預治療。其中LV-PRRX1組裸鼠又隨機分為2組：LV-PRRX1組及LV-PRRX1+XAV939處理組(n=5)。治療時，對照組、LV-CON組及LV-PRRX1組每只裸鼠均行0.2 ml生理鹽水腫瘤處注射；而LV-PRRX1+XAV939處理組每只裸鼠行0.2 ml XAV939生理鹽水注射液(XAV939濃度：0.25 mg/ml)腫瘤處注射，每周2次；連續治療4周。治療期間密切觀察裸鼠的生存狀態，從治療當天起，每4 d測量1次瘤體，瘤體計算公式為：V=L×W2/2(L：瘤體長度；W：瘤體寬度)。末次測量后，裸鼠脫臼處死，切除腫瘤并拍照。后將每組一部分腫瘤保存在4%多聚甲醛中固定，另一部分-80℃凍存備用。

1.2.5HE染色觀察瘤體組織病理變化 取固定了48 h的各組裸鼠瘤體標本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作病理切片(厚度3 μm)。將石蠟切片依次再經脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.6TUNEL染色檢測瘤體組織細胞凋亡 將制作好的瘤體石蠟切片(厚度5 μm)依次進行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反應混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用PBS沖洗3次；加入50 μl轉化劑-POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μl DAB底物，于25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；蘇木素復染、脫水、透明；封片，光鏡下觀察；陽性結果判斷：陽性染色的細胞核染成棕褐色，為凋亡細胞。隨機選擇3個視野，觀察凋亡細胞并計算凋亡率。

1.2.7免疫組化檢測瘤體組織Ki-67表達 根據試劑盒操作，將制作好的瘤體石蠟切片(厚度5 μm)依次進行Ki-67染色處理：將制備的組織用檸檬酸緩沖液(pH=6)處理20 min進行抗原修復；然后，將組織置于3% H2O2中，常溫加濕室中10 min，消除內源性過氧化物酶活性，再用PBS沖洗3次；加入兔抗人Ki-67一抗(稀釋比1∶500)在4℃下，孵育過夜；然后滴加即用型HRP標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶500)室溫孵育30 min；DAB顯色后蘇木精復染3 min。著色后，用梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)和二甲苯脫水，用中性樹脂固定、封片。光學顯微鏡下觀察Ki-67陽性細胞并統計陽性率。

1.2.8Western blot檢測瘤體組織蛋白表達 取-80℃凍存的各組細胞或瘤體組織，分別進行全蛋白提取，后進行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗(PRRX1，1∶1 000；β-catenin，1∶1 000；c-Myc，1∶800；β-actin，1∶1 500)在4℃下，孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的兔抗羊IgG二抗(1∶2 500)或羊抗兔IgG二抗(1∶2 500)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學發光進行顯色。以β-actin為內參蛋白，采用Quantity One圖像處理軟件對各指標灰度值進行半定量分析。

2 結果

2.1LV-PRRX1慢病毒感染促進了SMMC-7721細胞PRRX1蛋白表達 Western blot檢測各感染組SMMC-7721細胞中PRRX1蛋白的表達情況。與正常對照組比較，LV-CON組細胞PRRX1蛋白水平無顯著差異；與LV-CON組比較，LV-PRRX1組細胞PRRX1蛋白水平顯著增加(P<0.05，圖1)。說明PRRX1過表達的穩轉SMMC-7721細胞株構建成功。

2.2PRRX1過表達抑制了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的生長 采用生理鹽水或XAV939對移植瘤進行干預并繪制移植瘤生長曲線。與正常對照組比較，LV-CON組裸鼠移植瘤生長速度無顯著差異(圖2)；從治療12 d起，與LV-CON組比較，LV-PRRX1組裸鼠移植瘤體積顯著降低(P<0.05)，腫瘤生長緩慢；從治療20 d起，與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯合XAV939組裸鼠移植瘤體積顯著降低(P<0.05)，腫瘤生長進一步減慢；治療28 d取樣結果顯示，LV-PRRX1組裸鼠移植瘤體積顯著低于LV-CON組，而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯合XAV939組裸鼠移植瘤體積更小。提示PRRX1過表達顯著抑制SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的生長，且XAV939對這一效應具有一定的促進作用。

圖1 Western blot檢測各組細胞中PRRX1蛋白表達Fig.1 Protein expression of PRRX1 in each group was tested by Western blotNote:1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1 group.Com-pared with LV-CON group，*.P

圖2 各組裸鼠移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curve of transplanted tumor in each groupNote:A.Tumor growth curve；B.Transplanted tumor at 28th day.1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compared with LV-CON group,*.P P

2.3PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織壞死 采用HE染色觀察各組裸鼠移植瘤的病理學變化(圖3)。正常對照組與LV-CON組移植瘤組織中腫瘤細胞細胞核明顯、分布密集，且著色較深，細胞相對完整；LV-PRRX1組腫瘤細胞細胞核固縮，細胞間隙變大，分布彌散，有淋巴細胞浸潤現象；而LV-PRRX1聯合XAV939組細胞核固縮、淋巴細胞浸潤現象更加明顯，部分細胞壞死。提示PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織壞死，而且XAV939能進一步促進這一作用。

2.4PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡 采用TUNEL染色觀察各組裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡狀況(圖4)。正常對照組與LV-CON組移植瘤組織中腫瘤細胞凋亡率無顯著差異；與LV-CON組比較，LV-PRRX1組腫瘤細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯合XAV939組腫瘤細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。提示PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡，而且XAV939能進一步促進這一作用。

圖3 HE染色觀察移植瘤病理變化(×200)Fig.3 Pathological changes of transplanted tumor were observed by HE staining(×200)Note:1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.

圖4 TUNEL染色檢測各組移植瘤腫瘤細胞凋亡(×200)Fig.4 Apoptosis of tumor cells of transplanted tumors in each group was detected by TUNEL staining(×200)Note:A.TUNEL staining；B.Percentage of apoptotic cells.1.control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compard with LV-CON group,*.P P

圖5 免疫組化檢測各組移植瘤中Ki-67的表達(×200)Fig.5 Expression of Ki-67 in transplanted tumor tissue was detected by immunohistochemical staining(×200)Note:A.Immunohistochemical staining；B.Percentage of positive cells.1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1 group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compared with LV-CON group,*.P P

圖6 Western blot檢測各指標蛋白表達水平Fig.6 Protein expression levels of each indicator were tested by Western blotNote:1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1 group.4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compared with LV-CON group,*.P P

2.5PRRX1過表達抑制了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤中Ki-67的表達 采用免疫組化觀察各組裸鼠移植瘤中Ki-67的表達(圖5)。正常對照組與LV-CON組Ki-67陽性細胞占比無顯著差異；與LV-CON組比較，LV-PRRX1組Ki-67陽性細胞占比顯著降低(P<0.05)；而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯合XAV939組Ki-67陽性細胞占比顯著降低(P<0.05)。提示PRRX1過表達抑制了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤中Ki-67的表達，而且XAV939能進一步促進這一作用。

2.6Wnt/β-catenin信號通路參與PRRX1過表達對SMMC-7721細胞體內致瘤性的調控 采用Western blot檢測各組移植瘤中PRRX1蛋白及Wnt/β-catenin通路相關蛋白β-catenin、c-Myc的表達(圖6)。與LV-CON組比較，LV-PRRX1組PRRX1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，β-catenin、c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)；而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯合XAV939組PRRX1蛋白水平無顯著變化，而β-catenin、c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)。提示PRRX1過表達通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而發揮抗腫瘤作用。

3 討論

已有研究表明，低表達的PRRX1是HCC患者擁有較差5年生存期的獨立預后因素；下調PRRX1的表達能通過獲取腫瘤干細胞樣屬性促進HCC患者的不良預后[18]。Wnt/β-catenin是一種在進化過程中高度保守的信號通路，且已被證明在包括HCC在內的多種多發性腫瘤中過度活躍[19,20]。本研究主要研究過表達PRRX1是否通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低肝癌細胞的體內致瘤性。

不同于一般的EMT誘導劑，PRRX1作為一種新的EMT誘導劑已被證明參與腫瘤干細胞特性的獲取，且PRRX1的缺失促進了乳腺癌和HCC在體內的轉移[14,18]。而本研究顯示，過表達PRRX1顯著抑制了肝癌細胞裸鼠移植瘤的生長。但過表達PRRX1被證明與結直腸癌的不良預后和轉移密切相關[15]。在對于HCC細胞的生物學屬性進行研究時發現，下調PRRX1的表達顯著抑制了HCC細胞的凋亡，并促進了遷移和侵襲能力[17]。但在胃癌和肺癌的相關研究中發現，顯著上調PRRX1的表達才能增加癌細胞的EMT屬性，主要表現為細胞增殖、遷移和侵襲能力的增加[16,21]。這提示PRRX1作用在不同類型腫瘤中的存在異質性。此外，PRRX1同樣參與腫瘤化學抗性的調控，例如在人肝癌細胞株(HuH7、Hep3B、HepG2和PLC/PRF/5)中，過表達PRRX1增加了對5-FU的藥物敏感性[18]。同樣在肝癌細胞株中，過表達PRRX1降低了放療、化療過程中的腫瘤干細胞陽性率[22]。結合本研究其他實驗結果，過表達PRRX1促進了移植瘤的組織壞死，增加了瘤體組織的腫瘤細胞凋亡，下調了瘤體組織Ki-67的表達；我們證實過表達PRRX1能顯著降低肝癌細胞的體內致瘤能力。

異常激活Wnt/β-catenin信號通路在許多類型的人類腫瘤中普遍存在，且它被認為能促進腫瘤的發展。抑制Wnt/β-catenin信號通路成為多種腫瘤靶向治療的有效途徑。例如，在食管鱗狀細胞癌中，婆羅雙樹樣基因4(SALL4)沉默被證明能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化來促進癌細胞EMT向MET轉化，進而抑制癌細胞體外的生存、遷移、侵襲及抗藥性，以及體內成瘤能力[23]。以siRNA干擾β-catenin的表達能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路顯著增加食管癌順鉑化療的敏感性[24]。而在HCC中，Wnt/β-catenin信號通路被證明參與了miR-610介導的癌細胞生物學習性，下調miR-610的表達能激活Wnt/β-catenin信號通路促進癌細胞的增殖活性、周期進程及體內致瘤能力[25]。在乳腺癌中，miR-1299過表達通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進癌細胞的增殖及成瘤能力[26]。在宮頸癌中，沉默孤核受體DAX1能顯著抑制癌細胞的體外增殖、癌癥干細胞屬性以及體內成瘤能力，且這一效應同樣被證明與抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化有關[27]。在本研究中我們發現，PRRX1過表達能顯著降低Wnt/β-catenin信號通路核心蛋白β-catenin以及其下游效應因子c-Myc的表達水平；Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939對PRRX1過表達抑制移植瘤的生長具有協同作用，提示Wnt/β-catenin通路參與了PRRX1介導的肝癌細胞體內致瘤能力的調控。

綜上所述，PRRX1過表達能顯著抑制肝癌細胞體內致瘤性，主要表現為促進瘤體組織壞死，促進腫瘤細胞凋亡，進而抑制移植瘤的惡性生長。這一機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路密切相關，聯合應用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑和PRRX1過表達調控可能成為肝癌治療十分具有潛力的方案。