活細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于體外檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性的方法建立①

王佳佳 王 磊 宋興輝 李艷偉 郭 春 黃瑩瑩 劉 麗

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺,杭州 310058)

巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能對實(shí)現(xiàn)機(jī)體的天然免疫防御和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是至關(guān)重要的[1-3]。人們在研究巨噬細(xì)胞的吞噬活性即其對顆粒物的攝取時，以往常用方法有顯微鏡觀察和計數(shù)或流式細(xì)胞術(shù)檢測被吞噬顆粒標(biāo)記的熒光素信號確定單個樣本的吞噬率[4-6]。

然而多項(xiàng)研究表明，巨噬細(xì)胞對待吞噬顆粒的吞噬功能與兩者作用比例相關(guān)[7，8]，即在巨噬細(xì)胞發(fā)生吞噬作用時，巨噬細(xì)胞和待吞噬顆粒物比例直接影響吞噬率的結(jié)果，對于經(jīng)過體外特定處理的巨噬細(xì)胞，如經(jīng)IFN-γ刺激或者RNA干擾特定基因等，常會出現(xiàn)細(xì)胞量與對照組的不一致。在此情況下，比較特定處理對吞噬功能的影響時，經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞和對照巨噬細(xì)胞需進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整巨噬細(xì)胞和待吞噬顆粒物比例一致，方可后續(xù)試驗(yàn)。該步驟必不可少，卻存在細(xì)胞計數(shù)不準(zhǔn)確和嚴(yán)重耗時的問題，直接影響巨噬細(xì)胞的活性和吞噬率結(jié)果的準(zhǔn)確性。

因此，對體外巨噬細(xì)胞吞噬活性的研究來說，保證樣本和對照細(xì)胞在一樣的環(huán)境體系下完成吞噬過程，結(jié)果既準(zhǔn)確又可靠就顯得非常必要。本研究旨在通過活細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，建立一種簡便可靠的方法研究體外巨噬細(xì)胞的吞噬活性。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7來自實(shí)驗(yàn)室保種細(xì)胞； Cell TraceTMCFSE Cell Proliferation Kit(no.C34570)購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品；胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA購自Gibco公司；Alexa Fluor 594標(biāo)記的大腸桿菌(E.coli)k-12購自Molecular Probes公司；脂多糖LPS(L2880)購自Sigma公司。

流式細(xì)胞分析儀型號為美國Becton Dickinson公司的Fortessa和ACEA公司的Novocyte；非接觸超聲破碎儀Bioruptor為 Diagenode 公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為德國蔡司的Axio Observer A1。

1.2方法

1.2.1RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，然后放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2熒光標(biāo)記的大腸桿菌超聲預(yù)處理 將Alexa594熒光標(biāo)記的大腸桿菌顆粒溶解在1 ml的PBS中，充分振蕩均勻。非接觸超聲破碎儀在4℃處理20 s、40 s、60 s(60 kHz和300 W功率)，熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的大腸桿菌顆粒處理情況。

1.2.3RAW264.7細(xì)胞CFSE染色 取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞約5×106個重懸在0.5 ml 無菌PBS中；CFSE貯存液(5 mmol/L)0.4 μl 溶解于0.5 ml的PBS溶液；細(xì)胞懸液與CFSE染液充分混勻，室溫孵育10 min(CFSE染液工作終濃度 2 μmol/L)；1 ml的細(xì)胞染液加9 ml含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基終止反應(yīng)，室溫放置10 min；離心去除上清，細(xì)胞沉淀用含10%FBS的培養(yǎng)基重懸，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4吞噬試驗(yàn) 6孔板每孔鋪約5×105個細(xì)胞，以一定比例加入Alexa594標(biāo)記的大腸桿菌，在細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下置于CO2培養(yǎng)箱一定時間。吸掉培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗滌2次，臺盼藍(lán)處理3 min淬滅細(xì)胞表面黏附的熒光顆粒，預(yù)冷PBS洗滌2次，胰酶消化貼壁細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸，離心將細(xì)胞沉淀重懸在0.5 ml的PBS緩沖液中，50 μm孔徑的細(xì)胞篩過濾，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.5不同細(xì)胞與大腸桿菌比例、吞噬作用時間條件的摸索 取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整每樣本以5×105個細(xì)胞接種于6孔板單個孔中。細(xì)胞設(shè)置9組，分別以細(xì)胞與大腸桿菌比例為1∶1、1∶5、1∶10 ，每種細(xì)胞與大腸桿菌比例對應(yīng)3個孵育時間15 min、30 min、60 min，如1.2.4完成吞噬試驗(yàn)。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整每樣本以5×105個細(xì)胞接種于6孔板單個孔中。細(xì)胞設(shè)置3組，分別以細(xì)胞與大腸桿菌比例為1∶25、1∶50、1∶100 ，孵育時間30 min，如1.2.4完成吞噬試驗(yàn)。

1.2.6應(yīng)用活細(xì)胞標(biāo)記在同一體系中完成LPS處理和未處理細(xì)胞的吞噬活性檢測 取RAW264.7巨噬細(xì)胞用0.01 μg/ml的LPS處理16 h，經(jīng)處理的細(xì)胞和標(biāo)記CFSE的對照細(xì)胞混勻，在一個體系中和熒光標(biāo)記的大腸桿菌孵育，吞噬條件是細(xì)胞與大腸桿菌比例為1∶10，孵育時間是30 min，如1.2.4完成吞噬試驗(yàn)。

1.2.7CFSE對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 設(shè)計3組吞噬試驗(yàn)，第1組不做任何處理的CFSE標(biāo)記的RAW264.7巨噬細(xì)胞和CFSE未標(biāo)記巨噬細(xì)胞混勻加入大腸桿菌完成吞噬；第2組是LPS處理的CFSE未染色細(xì)胞和不做處理的CFSE染色細(xì)胞混勻吞噬；第3組是LPS處理的CFSE染色細(xì)胞和不做處理的CFSE未染色細(xì)胞混勻吞噬。吞噬條件是細(xì)胞與大腸桿菌比例為1∶10，孵育時間是30 min，如1.2.4完成吞噬試驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism7.0軟件分析，采用配對t檢驗(yàn)比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。流式數(shù)據(jù)使用FlowJo V10軟件分析。

2 結(jié)果

2.1熒光標(biāo)記的大腸桿菌超聲預(yù)處理?xiàng)l件 熒光標(biāo)記的大腸桿菌顆粒溶液在不同條件下超聲處理，熒光顯微鏡下觀察，確定可獲得單個大腸桿菌顆粒的超聲條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明，大腸桿菌顆粒溶液在未超聲處理時存在大量的團(tuán)塊聚集體，超聲20 s顆粒團(tuán)塊聚集體的情況明顯改善，超聲40 s大腸桿菌顆粒基本分散為單個細(xì)胞，超聲處理60 s大腸桿菌顆粒更好地分散為單個細(xì)胞，且由于沒有團(tuán)塊存在，可看到有效的單顆粒的量明顯增加。長時間的超聲會破碎大腸桿菌，盡可能使用能將顆粒分散均勻的最短超聲條件為佳。因此，將熒光標(biāo)記的大腸桿菌顆粒進(jìn)行60 s超聲處理可獲得均一性好、分散的單個大腸桿菌顆粒溶液，更好地用作后續(xù)的吞噬試驗(yàn)。對均勻分散的大腸桿菌顆粒用軟件計數(shù)，計算大腸桿菌溶液密度約為2.5×106個/μl。

2.2RAW264.7細(xì)胞的CFSE染色 活細(xì)胞示蹤染料CFSE標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞情況(圖2)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，熒光染色均勻，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3細(xì)胞與大腸桿菌比例、孵育作用時間的條件確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3B)顯示，細(xì)胞吞噬率隨著大腸桿菌與細(xì)胞的比例增加而升高，隨孵育時間增長(15 min 到60 min)而升高。但是細(xì)胞從15 min到30 min，細(xì)胞吞噬率上升速度較快，從30 min到60 min，細(xì)胞吞噬率上升速度在減緩，為了檢測細(xì)胞的吞噬活性功能，將確定30 min為細(xì)胞吞噬活性的較佳孵育時間。 在確定孵育時間后， 進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞與待吞噬物大腸桿菌比例。提高細(xì)胞與大腸桿菌的比例為1∶25、1∶50、1∶100，檢測吞噬率分別為82.2%、92.8%、98.1%，結(jié)果為較高的細(xì)胞吞噬率，若以這些比例完成吞噬檢測，僅靠吞噬率將難以比較出實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3A、C)，確定1∶5到1∶10為較佳的細(xì)胞與大腸桿菌比例。

圖1 熒光標(biāo)記的大腸桿菌超聲處理后熒光顯微鏡下觀察(×400)Fig.1 Observation of sonication-treated E.coli by fluore-scent microscope labeled with Alexa594(×400)Note: E.coli untreated with sonication (A) and E.coli sonicated with different time of 20 s (B),40 s(C) and 60 s(D).

圖2 熒光顯微鏡下觀察CFSE染色的RAW264.7細(xì)胞(×200)Fig.2 Observation of RAW264.7 labeled with CFSE by fluorescent microscope(×200)Note:A.White light;B.Fluoresent.

圖3 巨噬細(xì)胞在不同吞噬條件下的吞噬率Fig.3 Percentage of phagocytic cells under different phagocytic conditionsNote: A，B.The percentage of phagocytic cells under different incubation time or ratios of cells to E.coli as shown by column diagram and line chart；C.The percentage of phagocytic cells treated with different ratios of cells to E.coli represented by Column diagram.

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析LPS對巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.4 Influences of LPS on phagocytotic activities of macrophage analyzed by flow cytometryNote: A.Only live cells were gated in the “cell” on dot-plot of FSC-A and SSC-A;B.Single cells were then gated in “single cells” on dot-plot of FSC-A and FSC-H from region “cell”;C.Population from the region “single cells” was distinguished into CFSE+ and CFSE-subpopulations based on CFSE fluorescence intensity;D,E.Cells from region “CFSE+” and “CFSE-” are further analyzed for the percentages of phagocytic cells which were indicated by the number in the outlined areas.

圖5 CFSE標(biāo)記對細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.5 Influences of CFSE on phagocytic activities of macrophage analyzed by flow cytometryNote: A.The gating strategy of flow cytometry is the same as Figure 4.Cells from region “CFSE+” and “CFSE-” are further analyzed for the percentages of phagocytic cells.Three groups of experiments are shown in (1),(2) and (3).Data are representative of the experiment in each group；B.The percentages of phagocytic cells corresponding to figure A (2) and (3) were represented by Column diagram.Error bars show in each group.

2.4應(yīng)用活細(xì)胞標(biāo)記在同一體系中完成LPS處理和未處理細(xì)胞的吞噬活性檢測 活細(xì)胞示蹤染料CFSE標(biāo)記對照組巨噬細(xì)胞，對未標(biāo)記CFSE的巨噬細(xì)胞使用免疫刺激劑LPS處理，標(biāo)記CFSE的細(xì)胞不做任何處理即對照組巨噬細(xì)胞。將LPS處理的巨噬細(xì)胞和對照組巨噬細(xì)胞混合，在一個體系中和Alexa594標(biāo)記的大腸桿菌孵育完成吞噬過程，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測吞噬結(jié)果。流式設(shè)門分析如圖4，在FSC-A和SSC-A散點(diǎn)圖中設(shè)橢圓形門圈定主細(xì)胞群，排除細(xì)胞碎片和狀態(tài)不好的細(xì)胞(圖4A)，然后在FSC-A和FSC-H散點(diǎn)圖中設(shè)門圈定單細(xì)胞群，排除細(xì)胞聚集體(圖4B)，然后在Alexa594-A和CFSE-A雙熒光散點(diǎn)圖中分別設(shè)門圈出CFSE陽性細(xì)胞和CFSE陰性細(xì)胞(圖4C)，對CFSE陽性細(xì)胞用Alexa594-A作單參數(shù)直方圖分析其Alexa594陽性率即對照組細(xì)胞吞噬率為48.6%(圖4D)，對CFSE陰性細(xì)胞分析也就是LPS處理的靶巨噬細(xì)胞吞噬率為62.3%(圖4D)。結(jié)果表明，LPS處理后細(xì)胞吞噬活性顯著增加，與文獻(xiàn)報道一致。實(shí)驗(yàn)也表明，通過活細(xì)胞標(biāo)記區(qū)分，在同一體系中完成LPS處理和未處理細(xì)胞的吞噬活性檢測是非常可行的；并且，對照組和處理組細(xì)胞處在同一個吞噬環(huán)境中，吞噬率反映的吞噬活性更為準(zhǔn)確。

2.5CFSE對巨噬細(xì)胞的吞噬活性影響 研究設(shè)計3組吞噬試驗(yàn)，第1組是不做任何處理的CFSE標(biāo)記細(xì)胞和CFSE未標(biāo)記細(xì)胞混勻加入大腸桿菌完成吞噬，也就是混合的兩種細(xì)胞是一樣的細(xì)胞，只是一群細(xì)胞進(jìn)行了活細(xì)胞染色，結(jié)果顯示[圖5A(1)]二者的吞噬率是非常接近的，這說明活細(xì)胞染料CFSE(染液工作終濃度2 μmol/L)對細(xì)胞的吞噬功能活性沒有影響。第2組是LPS處理的CFSE未染色細(xì)胞和不做處理的CFSE染色細(xì)胞混勻吞噬，第3組是LPS處理的CFSE染色細(xì)胞和不做處理的CFSE未染色細(xì)胞混勻吞噬，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5A(2)、5A(3)、4B，顯示LPS處理的細(xì)胞均表現(xiàn)出高于未處理細(xì)胞的吞噬率，且結(jié)果均有顯著性差異(P<0.05)，這也說明CFSE染色對細(xì)胞吞噬活性沒有影響，實(shí)驗(yàn)中選取CFSE標(biāo)記的細(xì)胞或者CFSE未標(biāo)記的細(xì)胞做處理組都可以，結(jié)果是一致的。

3 討論

巨噬細(xì)胞是人們研究細(xì)胞吞噬功能的主要對象，以其對顆粒物的攝取即吞噬率或吞噬指數(shù)來反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

普通來講，測定吞噬率的方法是對吞噬顆粒物進(jìn)行普通染色或者熒光標(biāo)記，吞噬細(xì)胞與待吞顆粒物孵育后，在顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察和計數(shù)來計算吞噬細(xì)胞對顆粒物的吞噬情況[4]，這種方法操作較為繁瑣且準(zhǔn)確性差。流式細(xì)胞術(shù)利用流式細(xì)胞儀可實(shí)現(xiàn)對液流狀態(tài)下的單列細(xì)胞進(jìn)行逐個、快速、多參數(shù)的定性和定量分析，可獲得細(xì)胞大小、顆粒度和熒光信號等參數(shù)信息。自1982年由Steinkamp等[5]開創(chuàng)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對熒光微球的吞噬功能以來，越來越多的研究者利用流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬帶有熒光信號的顆粒物，如檢測吞噬細(xì)胞吞噬熒光微球、檢測吞噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記的細(xì)菌[6,7]。

然而吞噬率與細(xì)胞數(shù)和被吞噬顆粒比例有極大關(guān)系[7，8]，用流式檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性的缺點(diǎn)是，待比較吞噬活性的樣本需要通過細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)和被吞噬顆粒比例一致，結(jié)果才可靠。該步驟必不可少，卻存在細(xì)胞計數(shù)不準(zhǔn)確和嚴(yán)重耗時的問題，直接影響巨噬細(xì)胞的活性和吞噬率結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究在以下方面做了探索。首先優(yōu)化了巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測的條件。一是待吞噬物大腸桿菌的超聲條件，非接觸超聲破碎儀以60 kHz和300 W功率4℃處理60 s，可獲得均一性好、分散的單個大腸桿菌顆粒。巨噬細(xì)胞的吞噬對象常見的是細(xì)菌、包被微球等，這些在經(jīng)熒光標(biāo)記后不管是洗過的沉淀顆粒還是凍干的干粉，依靠振蕩重懸難以達(dá)到理想的單個顆粒，而團(tuán)塊對后續(xù)吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，會造成有效的單顆粒數(shù)量下降、吞噬指數(shù)不準(zhǔn)確。二是確定30 min為細(xì)胞吞噬活性檢測的最佳孵育時間，1∶5到1∶10左右為較佳的細(xì)胞與待吞噬物比例，這兩個條件對于檢測巨噬細(xì)胞系體外吞噬活性更為合適。

研究通過活細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用來檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性。采用活細(xì)胞示蹤染料CFSE標(biāo)記對照組巨噬細(xì)胞，對未標(biāo)記CFSE的巨噬細(xì)胞使用免疫刺激劑LPS處理，標(biāo)記CFSE的細(xì)胞不做任何處理即對照組巨噬細(xì)胞。將LPS處理的巨噬細(xì)胞和對照組巨噬細(xì)胞混合，在一個體系中和Alexa594標(biāo)記的大腸桿菌孵育完成吞噬過程，通過流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門分析可同時獲得LPS處理的巨噬細(xì)胞和對照組巨噬細(xì)胞的吞噬率，結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。這表明通過活細(xì)胞標(biāo)記區(qū)分，在同一體系中完成LPS處理和未處理細(xì)胞的吞噬活性檢測是非常可行的；并且，對照組和處理組細(xì)胞處在同一個吞噬環(huán)境中，吞噬率反映的吞噬活性更為準(zhǔn)確；研究選用的兩種熒光信號CFSE和Alexa594屬于不同激光器激發(fā)的熒光素，沒有熒光溢漏，這不僅意味著流式檢測時不需要補(bǔ)償調(diào)節(jié)，更意味著細(xì)胞分群更清晰(圖4C)，流式設(shè)門更準(zhǔn)確；與以往的流式檢測單熒光信號的吞噬功能相比，雖增加了活細(xì)胞標(biāo)記，省卻了吞噬試驗(yàn)之前對樣本進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和調(diào)整細(xì)胞量的步驟。

研究進(jìn)一步探索了活細(xì)胞示蹤染料CFSE是否會對巨噬細(xì)胞的吞噬功能造成影響。研究設(shè)計三組試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明了活細(xì)胞示蹤染料CFSE對細(xì)胞的吞噬功能活性沒有影響，在活細(xì)胞標(biāo)記后選取CFSE標(biāo)記或者CFSE未標(biāo)記的細(xì)胞做處理組都可以，結(jié)果是一致的。

綜上所述，本研究通過活細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用，建立了一種簡便、可信度高的方法研究體外處理的巨噬細(xì)胞的吞噬活性。活細(xì)胞標(biāo)記簡化了以往對吞噬研究前期的處理步驟并能確保細(xì)胞吞噬條件一致，加之流式細(xì)胞術(shù)的快速檢測，可以說該檢測方法是簡便、快速、準(zhǔn)確的。該檢測方法對于研究巨噬細(xì)胞的吞噬活性來講，具有方法學(xué)方面的指導(dǎo)意義，同時對活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)的推廣有一定作用。