檸檬苦素調控Tiam1基因表達影響人體血管瘤內皮細胞VEGF/VEGFR2通路及誘導其凋亡的機制研究①

李立佳 符梅竹 黃惠敏 鄭詩華 閻青青 張曉鈿

(海南醫學院第一附屬醫院兒科，海口 570102)

血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤，多發于面頸部、四肢、口腔黏膜、肌肉、肝臟等[1]。隨著年齡逐漸增長，部分患兒的血管瘤可自行消退，而另外一部分患兒的血管瘤則不斷增殖，影響患兒的外貌和身心健康[2]。當前，血管瘤通常采用激光手術和藥物等方式進行治療，而其發病和消退機制尚不完全清楚。

Toonaciliatin A是一種檸檬苦素類似物，研究發現其能夠抑制腫瘤細胞的增殖并誘導癌細胞凋亡[3,4]。T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因(T lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1,Tiam1)是從小鼠T淋巴瘤細胞系中克隆出來的，在人類多種腫瘤細胞系中異常表達，與細胞的增殖、凋亡等過程密切相關[5-7]。研究發現，Tiam1在血管瘤增生期表達上調，與血管瘤增殖有關[8]。VEGF信號轉導通路在血管瘤發展中發揮作用，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其受體VEGFR2在此通路中起重要作用[9]。VEGF及其受體在增生期的血管瘤標本中表達顯著上調，與血管瘤的增殖密切相關[10]。

本課題以分離所得的血管瘤內皮細胞(hemangioma-derived endothelial cells,HemEC)為研究對象，采用不同濃度檸檬苦素類似物Toonaciliatin A處理HemEC，研究Toonaciliatin A對HemEC細胞增殖和凋亡的影響，及Tiam1基因和VEGF信號通路在此機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人血管瘤內皮細胞(HemEC)由分離所得；RPMI1640培養基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司，檸檬苦素類似物Toonaciliatin A購自上海詩丹德生物技術有限公司；pcDNA-Tiam1質粒由本實驗組連接后測序驗證；雙抗、兔抗人第Ⅷ凝血因子抗體抗原、抗Tiam1抗體、抗VEGF抗體、抗VEGFR2抗體和抗β-actin抗體購自Abcam公司；胰蛋白酶Trypsin、膠原酶(collagenase)A、四氮唑藍(MTT)和二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取試劑盒、 Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；流式法細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀購自美國BD公司，顯微鏡、全自動酶標儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞分離和培養[11]血管瘤標本取自海南醫學院第一附屬醫院一女性患兒，年齡6個月，瘤體長勢快。實驗內容經患者監護人同意，并簽訂知情同意書。

將血管瘤標本用PBS緩沖液清洗3遍，然后剪碎(<1 mm3)，加入3倍體積的膠原酶A(0.2%)，37℃孵育1 h，將勻漿化的組織經100 μmol/L細胞過濾器過濾，加入NH4Cl溶解紅細胞。然后再經40 μmol/L 細胞過濾器過濾，獲得單細胞懸液。接種于含20% FBS、1% 青-鏈霉素的RPMI1640培養基中，于37℃ 5%CO2培養箱中常規培養，細胞培養至融合度90%左右，傳代培養，傳代至第3代后即可獲取較純的血管瘤內皮細胞(HemEC)，細胞鑒定存在第Ⅷ凝血因子相關抗原對其進行鑒定。待細胞培養至對數生長期時，無血清培養基培養48 h進行同步化處理，然后加入檸檬苦素類似物Toonaciliatin A(0、20、40、80 μg/ml)對細胞進行處理。

1.2.2細胞轉染 待HemEC細胞培養至對數生長期，稀釋為1×106個/ml，以每孔200 μl接種于6孔板中，培養至細胞融合度為80%～90%時進行轉染。先用無血清OptiMEM培養液稀釋脂質體Lipofectamine 2000、pcDNA和pcDNA-Tiam1(將Tiam1 cDNA插入pcDNA載體后測序驗證)，之后取等體積脂質體和載體混合，輕輕混勻，室溫孵育20 min，加入到培養好的細胞孔板中，混勻后置培養箱中繼續培養，培養6 h，換成完全培養基，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.3Real-time PCR檢測mRNA的表達 將Toonaciliatin A處理或轉染48 h的各組HemEC細胞進行收集，按照Total RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，測定濃度和純度后于-80℃保存。然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，反應程序為42℃45 min、70℃10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA按照Real-time PCR的說明書進行反應，反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35個循環；72℃ 10 min。Tiam1 上游引物 5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3 ′，下游引物 5 ′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′；VEGF 上游引物 5′-TTGACTGCTGTGGACTTGAG-3 ′，下游引物 5 ′-AGGACATAGGTCCTTTTAGG-3′；VEGFR2上游引物 5′-CCTACAAGTGCTTCTACCG-3′，下游引物 5 ′-TCAATCCCCACATTTAGTT-3′。運用Bio-Rad PCR檢測系統進行數據分析，經內參照β-actin進行校正。

1.2.4MTT實驗測定細胞生存率 將培養至對數生長期的HemEC細胞進行收集，分別加入終濃度為0、20、40、80 μg/ml的Toonaciliatin A后，再繼續培養24 h、48 h、72 h，加入 20 μl(5 g/L)MTT，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入150 μl DMSO溶解甲瓚結晶，室溫振蕩5 min，酶標儀測定OD492 nm 處的吸光度(A)值，按照公式生存率(%)=實驗組A均值/control組A均值×100%，計算生存率。找出半數抑制濃度最佳條件。

1.2.5流式細胞術測定細胞凋亡率 各組HemEC細胞經Toonaciliatin A處理后，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養72 h 后棄去培養液，胰酶消化，收集細胞，按照 Annexin V/PI 試劑盒說明書進行操作，加入 200 μl binding buffer重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 將轉染后經 Toonaciliatin A處理并培養48 h的各組HemEC細胞(對照組、檸檬苦素組、檸檬苦素+pcDNA組、檸檬苦素+pcDNA-Tiam1組)進行收集，加入RIPA 重懸細胞，冰浴超聲破碎收集蛋白，測定總蛋白濃度。每個樣本進行SDS-PAGE，然后轉膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(抗Tiam1 1∶500、抗VEGF抗體 1∶1 000 或抗VEGFR2 1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入1 000倍稀釋的二抗，室溫孵育1 h，以β-actin為內參照，分析蛋白表達水平。

2 結果

2.1Toonaciliatin A對人體血管瘤內皮細胞(HemEC)活性的影響 正常培養的血管瘤內皮細胞(HemEC)見圖1。

本文根據參考文獻[4]進行預實驗；最終選用Toonaciliatin A致HemEC細胞存活率在50%附近的3個濃度(20、40、80 μg/ml)進行試驗。

Toonaciliatin A處理人血管瘤內皮細胞(HemEC)24 h、48 h、72 h，MTT實驗結果顯示：與control組相比，20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組在24 h、48 h、72 h細胞生存率顯著下降(P<0.05)；與20 μg/ml組相比，40 μg/ml組、80 μg/ml組在24 h、48 h、72 h細胞生存率顯著下降(P<0.05)；與40 μg/ml組相比，80 μg/ml組在24 h、48 h、72 h細胞生存率顯著下降(P<0.05)，見圖2。說明Toonaciliatin A能夠抑制HemEC增殖。

2.2Toonaciliatin A對人體血管瘤內皮細胞凋亡的影響 流式細胞術實驗結果顯示(圖3、表1)，與control組相比，20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與20 μg/ml組相比，40 μg/ml組、80 μg/ml組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與40 μg/ml組相比，80 μg/ml組細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。說明Toonaciliatin A能夠促進HemEC凋亡。

2.3Toonaciliatin A對人體血管瘤內皮細胞Tiam1蛋白表達的影響 qRT-PCR和Western blot結果均顯示，與control組相比，20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組Tiam1表達量顯著下降(P<0.05)；與20 μg/ml組相比，40 μg/ml組、80 μg/ml組Tiam1表達量顯著下降(P<0.05)； 與40 μg/ml組相比，80 μg/ml組Tiam1表達量顯著下降(P<0.05)，見圖4和表2。說明Toonaciliatin A能夠抑制Tiam1蛋白表達。

圖1 正常培養的血管瘤內皮細胞Fig.1 Normally cultured hemangioma endothelial cells

圖2 Toonaciliatin A抑制人體血管瘤內皮細胞活性Fig.2 Toonaciliatin A inhibited cell viability of HemECNote: *.P PP

圖3 流式細胞術檢測檢測人體血管瘤內皮細胞凋亡Fig.3 Apoptosis of HemEC was detected by flow cytometry

GroupsCell apoptosis(%)Control5.85±0.4520 μg/ml13.88±1.071)40 μg/ml21.29±2.831)2)80 μg/ml26.42±3.111)2)3)F50.686P0.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs 20 μg/ml group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml group.

圖4 檢測人體血管瘤內皮細胞Tiam1蛋白表達Fig.4 Expression levels of Tiam1 protein in HemEC

GroupsTiam1 mRNATiam1 proteinControl4.63±0.050.63±0.0920 μg/ml3.37±0.041)0.39±0.051)40 μg/ml1.71±0.181)2)0.25±0.031)2)80 μg/ml1.15±0.111)2)3)0.14±0.031)2)3)F621.85243.250P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs 20 μg/ml group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml group.

根據以上實驗結果，選取處理時間48 h，抑制率為50%左右的Toonaciliatin A濃度(40 μg/ml)用作后續實驗。

2.4過表達Tiam1 逆轉Toonaciliatin A對HemEC的抑制作用 Western blot、流式細胞術和MTT結果顯示，與control組相比，40 μg/ml組Tiam1表達量顯著下降(P<0.05)，HemEC細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h細胞生存率顯著下降(P<0.05)；與pcDNA組相比，pcDNA-Tiam1組Tiam1表達量顯著上升(P<0.05)，HemEC細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h細胞生存率顯著上升(P<0.05)；與40 μg/ml+pcDNA組相比，40 μg/ml+pcDNA-Tiam1組Tiam1表達量顯著上升(P<0.05)，細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h細胞生存率顯著上升(P<0.05)，見圖5和表4。說明過表達Tiam1逆轉了Toonaciliatin A對HemEC的抑制作用。

圖5 檢測人體血管瘤內皮細胞Tiam1蛋白表達Fig.5 Expression levels of Tiam1 protein in HemECNote: *.P PP

GroupsTiam1 proteinApoptosis rate(%)Control0.63±0.066.18±0.7440 μg/ml0.26±0.031)22.46±1.681)pcDNA0.58±0.068.56±0.55pcDNA-Tiam10.84±0.082)3.29±0.342)40 μg/ml+pcDNA0.23±0.0224.29±2.4340 μg/ml+pcDNA-Tiam10.48±0.053)12.16±2.533)F55.80784.550P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs pcDNA group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml+pcDNA group.

2.5過表達Tiam1逆轉了Toonaciliatin A對人HemEC細胞VEGF/VEGFR2通路的影響 Western blot結果表明，與control組相比，40 μg/ml組VEGF和VEGFR2蛋白表達量均顯著下降(P<0.05)； 與pcDNA組相比，pcDNA-Tiam1組VEGF和VEGFR2蛋白表達量均顯著上升(P<0.05)；與40 μg/ml+pcDNA組相比，40 μg/ml+pcDNA-Tiam1組VEGF和VEGFR2蛋白表達量均顯著上升(P<0.05)，見圖6和表5。說明Toonaciliatin A能夠抑制VEGF和VEGFR2蛋白表達，過表達Tiam1逆轉了Toonacili-atin A對VEGF和VEGFR2蛋白表達的抑制作用。加大Toonaciliatin A的用量會對HemEC細胞存活影響較大，對VEGF/VEGFR2通路的影響也較大，過表達Tiam1便不能恢復。

圖6 檢測人體血管瘤內皮細胞VEGF/VEGFR2通路蛋白表達Fig.6 Expression levels of VEGF/VEGFR2 pathway proteins in HemEC

GroupsVEGF proteinVEGFR2 proteinControl0.85±0.090.57±0.0640 μg/ml0.39±0.041)0.22±0.041)pcDNA0.72±0.070.48±0.05pcDNA-Tiam10.89±0.092)0.63±0.062)40 μg/ml+pcDNA0.41±0.030.23±0.0440 μg/ml+pcDNA-Tiam10.66±0.083)0.41±0.053)F27.32834.208P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs pcDNA group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml+pcDNA group.

3 討論

早產、低體重、絨毛膜取樣、孕期癲癇等因素會提高新生兒血管瘤的發生率[1,12]。血管瘤通常在嬰兒出生后1周左右出現，在1歲內快速增殖，1歲左右逐漸消退，70%的患兒在7歲時都可消退，少部分繼續增殖面積變大需治療。血管瘤消退后可能出現瘢痕、萎縮、色素減退、血管擴張或皮膚松弛等癥狀，影響容貌，給患者及家屬帶來很大的心理創傷[2,13]。

檸檬苦素是引起柑橘苦味的重要物質，具有抗腫瘤增殖、抗菌性、鎮痛消炎等作用[14,15]。Toonaciliatin A是一種檸檬苦素類似物，提取自思茅紅椿(Toonaciliata Roem.var.henryi)[3]。丁怡等[4]研究表明，Toonaciliatin A能夠抑制胃癌細胞增殖并誘導癌細胞凋亡。本研究發現，Toonaciliatin A能夠抑制HemEC增殖，促進HemEC細胞凋亡，證實了Toonaciliatin A的腫瘤抑制作用。

Tiam1蛋白是鳥苷酸轉換因子GEF家族成員之一，可以特異性激活Rho GTPase家族中的Rac1，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多種腫瘤細胞中表達上調，且表達水平與腫瘤細胞的轉移侵襲能力有關[16]。Liu等[17]發現，Tiam1通過Wnt/β-連環蛋白信號調節EMT促進甲狀腺癌轉移。丁軼[18]發現Tiam1在肝癌細胞中表達上調，在肝硬化組織中低表達，在正常肝組織中不表達，沉默Tiam1可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲。劉涓等[8]研究表明，Tiam1在血管瘤細胞表達上調，對血管瘤的發生和發展密切相關。本研究結果表明，Toonaciliatin A抑制Tiam1蛋白表達，過表達Tiam1則逆轉了Toonaciliatin A對HemEC的抑制作用，說明Toonaciliatin A通過抑制Tiam1表達進而抑制血管瘤細胞的生長。

VEGF是血管內皮生長因子，其主要靶細胞是內皮細胞，選擇性刺激內皮細胞分裂，增加微血管通透性，改變細胞外基質，促進毛細血管穿透侵入組織內。VEGFR2是VEGF的受體2，通常低表達于正常組織的內皮細胞上。VEGF在腫瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞及增生期血管瘤中高表達，VEGFR2高表達于腫瘤血管內皮細胞[9,19]，抗VEGF/VEGFR用于腫瘤治療[20]。Wu等[21]發現在乳腺癌中，沉默Tiam1會抑制VEGF表達，Tiam1通過VEGF、ERK和AP-1途徑促進乳腺癌侵襲轉移。王啟船等[22]發現Tiam1和VEGF在食管鱗癌中高表達，兩者可能促進食管鱗癌血管內皮細胞的增殖。本研究發現Toonaciliatin A能夠抑制HemEC細胞中VEGF和VEGFR2蛋白表達，過表達Tiam1則會逆轉Toonaciliatin A對VEGF和VEGFR2蛋白表達的抑制作用。說明Toonaciliatin A通過靶向Tiam1抑制HemEC細胞中VEGF/VEGFR2通路蛋白的表達，間接證實了Tiam1與VEGF/VEGFR2通路存在調控關系。另外本研究還發現，加大Toonaciliatin A的用量會對HemEC細胞存活影響較大，對VEGF/VEGFR2通路的影響也較大，過表達Tiam1便不能恢復。

本研究首次闡述在HemEC細胞中檸檬苦素類似物Toonaciliatin A靶向Tiam1基因抑制VEGF/VEGFR2通路蛋白表達，從而抑制HemEC細胞增殖，促進HemEC細胞凋亡。檸檬苦素對人血管瘤具有潛在治療作用，本研究為人血管瘤的診斷和治療提供新的思路，對血管瘤發生、增殖和消退機制的基礎研究具有重要意義。