Hippo信號通路與炎癥的研究進展①

麻明彪 杜廷義 陶律延 屈柯暄 李小娟 計震華 簡苗苗 陳泰桂 羅麗莎 丁 喆 寶福凱 柳愛華

(昆明醫科大學基礎醫學院，昆明 650500)

Hippo信號通路，也稱之為Salvador/Warts/Hippo(SWH)通路，因該信號通路的關鍵蛋白激酶Hippo突變可使果蠅組織增生，表型像河馬而以此命名。1995年Justice等[1]對果蠅進行基因嵌合體篩查，首次在果蠅體內發現該信號通路中的Wts(Warts)基因，并且該基因參與調節細胞增殖及腫瘤抑制。1999年，Tao等[2]研究證實果蠅Wts的哺乳動物同源物大腫瘤抑制子(Large tumor suppressor，Lats)同樣具有抑制腫瘤的作用，其配體為細胞周期調節因子CDC2。隨后，研究其上游調控因子和下游其他作用受體引起了科學界的廣泛關注，2002年，2個研究團隊發現Salvador(Sav)為Wts的直接作用蛋白，該蛋白包含兩個WW結構域。Sav與Wts相互作用，通過調控Cyclin E和Diap的轉錄來抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[3,4]。2003年，研究者鑒定出腫瘤抑制基因Hippo(Hpo)，該基因編碼Ste-20家族蛋白激酶，并與哺乳動物體內MST1和MST2同源。此外，一系列研究發現，Hpo可以與Sav和Wts相互作用，通過相同信號通路抑制細胞增殖[5-9]。2005年，經鑒定，Mats被認為是Hippo通路的關鍵調節器，抑制Mats活性可導致大量組織生長，表型與由Hpo、Sav或Wts缺失所致者相似。同年，研究證實Yorkie為Hippo信號通路的核效應因子[10]。Hippo信號通路的相關重要發現按時間順序總結如圖1所示。之后，其他物種體內的Hippo信號通路相關分子組成元件也陸續被發現，并確定了該信號通路在調節細胞增殖和凋亡方面發揮著至關重要的作用。

1 Hippo信號通路

在果蠅(Drosophila)體內，經典的Hippo信號通路主要由一系列串聯激酶Hpo(Hippo)、Sav(Salvador)、Wts(Warts)、Mats(Mob as tumor suppressor)，轉錄共激活因子Yki(Yorkie)及其結合的轉錄因子Sd(Scalloped)組成，Hippo信號通路的激活和失活依賴于通路相關激酶級聯反應的激活與失活。在上游調控信號作用下，核心激酶發生激酶級聯反應，最初Hpo自磷酸化，與支架蛋白Sav形成復合物，Hpo-Sav復合物進而活化Mats和Wts，形成Wts-Mats復合物，隨即磷酸化下游的效應因子Yki，使其與細胞質內細胞骨架蛋白14-3-3蛋白相結合而滯留于胞漿中，由此不能進入細胞核與轉錄因子Sd相互作用，從而發揮抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的作用[14](圖2)。

圖1 Hippo信號通路相關重要發現的時間順序[11-13]Fig.1 Time of important discoveries related to Hippo signaling pathway[11-13]

Hippo信號通路在進化上高度保守，其核心成員在哺乳動物體內有對應果蠅的同源蛋白分子，MST1/2(mammalian sterile 20-like kinase 1/2)、SAV1(human Salvador 1)、LATS1/2(Large tumor suppressor 1/2)、MOB1(Mps One Binder kinase activator-like 1)、YAP(Yes-associated protein)/TAZ(Tafazzin)及TEAD(TEA domain family member)分別為果蠅中Hpo、Sav、Wts、Mats、Yki及Sd的同源蛋白，且可發生與果蠅類似的逐級磷酸化過程。其中MST1/2和LATS1/2是哺乳動物經典Hippo 信號通路的核心激酶，MST1/2磷酸化可激活通路蛋白SAV1、LATS1/2及MOB1。此外，活化的MST1/2可通過結構域SARAH(Sav/Rassf/Hpo)與構架蛋白SAV1(WW45)相互作用，形成MST1/2-SAV1復合體，該復合體可增強MST1/2對下游LAST1/2蛋白的磷酸化作用。經MST1/2活化的調節蛋白MOB1也可促進LATS1/2的磷酸化。活化的LAST1/2隨即磷酸化下游主要效應分子YAP及其旁系同源分子TAZ的第五位絲氨酸殘基，發生磷酸化的YAP/TAZ滯留在細胞質中而無法進入胞核，經泛素化后被蛋白酶降解[15-17]。而當Hippo信號通路被抑制或處于靜息狀態時，YAP發生核轉位聚集到細胞核中，與核內轉錄因子TEAD結合形成復合物，激活下游促進細胞增殖生長，抑制細胞凋亡的基因轉錄，如CTGF、AREG等，進而促進蛋白合成和組織器官生長[18](圖2)。

2 Hippo通路與炎癥

自發現以來，Hippo信號通路已成為哺乳動物調節細胞增殖和凋亡的信號傳導中樞。由Hippo通路核心元件MST1/2、LATS1/2、YAP/TAZ介導的經典信號傳導對于機體發育和組織內穩態的維持起著重要的調控作用。研究表明，異常的Hippo信號通路與機體免疫調節、腫瘤、心血管系統等疾病相關[19-21]。此外，隨著對Hippo信號通路的研究不斷深入，近年來研究發現Hippo信號通路還參與調節機體炎癥的發生、發展過程[22]。

炎癥是機體為消除各種外源性或內源性損傷因子，清除和吸收壞死組織細胞以及修復損傷的一種復雜的免疫防御性過程。炎癥的發生一方面可保護機體免遭損傷，另一方面，由于炎癥刺激的持續存在，炎癥微環境可導致細胞增殖、突變、壞死，甚至誘發腫瘤。多種免疫細胞及信號傳導通路(Jak/Stat信號通路、NF-κB信號通路和Toll樣受體信號通路等)介導了炎癥的發生，研究已證實炎癥的發生不僅僅依靠單一的炎癥通路進行信號的傳遞，Hippo信號通路相關分子也參與免疫細胞分化發育以及功能的調控，并且該信號通路與某些炎癥信號通路存在交互作用而共同參與調控炎癥的發生。

圖2 果蠅與哺乳動物的Hippo信號通路圖Fig.2 Hippo signaling pathway in Drosophila and mammals

2.1Hippo信號通路與免疫細胞分化發育 輔助性T細胞(helper T cell，Th)17和調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)是兩種在炎癥反應中起重要作用的CD4+T淋巴細胞亞型。兩種細胞在分化上相互聯系，在轉化生長因子β1(TGF-β1)單獨刺激下，初始CD4+T細胞可分化為Treg細胞，而在IL-10存在的條件下，TGF-β1和IL-6的共同刺激可促使初始CD4+T細胞分化為Th17細胞，同時抑制Treg細胞的產生[23]。同時，兩種細胞在功能上相互抑制，Th17細胞屬于“促炎細胞”，介導炎癥反應，該細胞表面表達多種炎性細胞因子受體，如趨化因子受體4(CCR4)、趨化因子受體6(CCR6)和IL-23受體(IL-23R)等，并且可分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22等多種細胞因子，其中IL-17A和IL-17F可進一步誘導單核/巨噬細胞、上皮細胞和成纖維細胞等合成分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-3和前列素E2(PGE2)，最終促進炎癥的發生[24]。而Treg細胞屬于“抑炎細胞”，介導免疫耐受，該細胞可表達高親和性的IL-2受體CD25和轉錄因子叉頭蛋白3(Foxp3)，可通過細胞與細胞間的接觸依賴性抑制或釋放抗炎細胞因子(如IL-10、IL-35和TGF-β等)發揮抗炎作用[25]。Th17細胞與Treg細胞在機體微環境中處于一種動態平衡的狀態，其失衡是導致機體多種炎性疾病和自身免疫性疾病的重要原因[26]。研究發現，MST1/2對Treg細胞和Th17細胞的發育和功能也起著重要的調控作用。MST1激酶可通過直接磷酸化轉錄因子Foxo1/3而增強其穩定性，或通過磷酸化Akt，抑制Akt磷酸化Foxo1/3的活性，間接增強Foxo1/3的穩定性，從而促進Foxp3表達和Treg細胞發育[27]。而敲除MST2對小鼠Treg細胞的發育無明顯影響，但在MST1/2雙敲除小鼠的胸腺中Treg的比例較MST1單敲小鼠明顯下降，由此表明MST1在Treg的發育與功能上起主導作用，而MST2在一定程度上可以代償性MST1的功能[27]。而對Th17細胞發育的調控，研究發現MST1缺失可促進Th17細胞的分化發育[28]。小鼠動物實驗也發現，敲除MST1/2的小鼠，Th17細胞的比例顯著增加，而Treg細胞的比例明顯下降，其機制為轉錄共激活因子TAZ可促進RORγt的轉錄活性，同時通過降低Foxp3蛋白的穩定性而抑制Foxp3的功能，從而促進Th17細胞的分化和減弱Treg細胞的產生。同時，研究也發現在初始CD4+T細胞分化為Treg細胞時，TEAD1的表達量明顯上升，但由于TAZ與TEAD1具有更高的結合親和力，從而阻斷了TAZ與RORγt，或Foxp3的相互作用，因此TEAD1的表達可增強初始CD4+T細胞分化為Treg細胞的能力[29]。雖然炎癥是多種免疫細胞介導的復雜反應，但Hippo信號通路對其他免疫細胞(如中性粒細胞、NK細胞和單核-吞噬細胞等)分化發育的調控研究少有報道，其中對MST1在B細胞的發育和功能中的研究，目前也只發現在MST1敲除小鼠中，外周血B細胞數目減少、脾邊緣區B細胞的缺失等。

2.2Hippo信號通路與Toll樣受體信號通路 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)活化和由此引起的下游促炎/抗炎細胞因子的分泌，導致機體免疫系統失衡是引起感染性炎癥的重要原因。TLRs是一組存在于宿主免疫細胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白，在機體非特異性免疫中發揮重要作用，同時也是連接特異性免疫和非特異性免疫的中間橋梁，該受體屬于模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，可識別微生物表面上結構恒定、進化保守的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，目前在人體內發現的TLRs 達11種。除TLR3外，Toll樣受體家族成員介導的炎癥反應都要通過一條經典的信號通路，即TLRs識別PAMP后，通過胞內TIR(Toll/IL-1R)區募集含有TIR結構域的接頭蛋白髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，通過其結合募集IL-1受體相關激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)家族蛋白，形成MyD88-IRAKs復合體，隨之依次活化IRAKs、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF-6)、轉化生長因子激酶1(transforming growth factor activated kinase-1，TAK1)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和IκB激酶 (inhibitor of NF-κB，IκB)，進而激活核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)，最終誘導促炎細胞因子的表達和釋放[30-33]。而TLR3 信號是通過TRIF(TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon β)或MyD88活化IRF-3，最終介導機體Ⅰ型干擾素的產生。

Toll樣受體信號通路在果蠅中也是調節體液免疫應答的主要信號通路之一，革蘭氏陽性菌感染后可啟動蛋白水解級聯反應，通過激活Toll受體的配體Spatzle (Spz)從而激活Toll信號通路，活化的Toll信號通過MyD88和蛋白激酶Pelle 促進Cactus (Cact) 蛋白磷酸化而降解，使NF-κB家族轉錄因子Dorsal (Dl)和Dorsal 相關免疫因子(Dif)轉位進入細胞核，最終誘導抗菌肽的表達而抵抗病原微生物的感染。Cact蛋白是一種含有細胞質錨蛋白重復序列的蛋白質，可通過將NF-κB家族轉錄因子Dl和Dif保留在細胞質中而降低抗菌肽的轉錄。Bo等[34]研究發現在果蠅中TLRs介導的Hippo信號通路在抗菌過程中具有重要調節作用。革蘭陽性菌與Toll樣受體作用后，可通過Toll-MyD88-Pelle級聯反應促進Hippo通路抑制性復合物STRIPAK-PP2A的必需亞基Cka發生磷酸化并降解，從而激活Hippo通路發生激酶級聯反應，當果蠅脂肪體中Hippo信號通路的抑制因子缺失或Yorkie激活時，會導致Cact的表達上升，使得抗菌肽的表達下降而容易被革蘭氏陽性菌所感染。這一研究結果闡明了在果蠅先天免疫中Toll受體通過Hippo信號通路調控Cact表達的分子機制，證明了Hippo信號通路在免疫應答中的調控作用，為Hippo信號通路的研究提供了新的思路。Geng等[35]研究發現，TLR1/2/4可誘導激酶Mst1和Mst2活化，活化的Mst1和Mst2激活蛋白激酶Cα(PKCα)，進而使LyGDI-Rac復合體部分磷酸化，Rac從復合物中解離出來，而TLR信號通路中的TRAF6與Rac結合，并催化Rac賴氨酸16的k63鏈發生多聚泛素化而活化，活化的Rac可促進TRAF6-ECSIT復合物的組裝，從而促進細胞內線粒體向吞噬小泡募集并使mROS生成增多，最終釋放大量的活性氧(ROS)以殺傷和清除吞噬小泡中的病原體。Wang等[36]研究發現，YAP能夠負調控機體的抗病毒免疫反應，YAP可與轉錄因子IRF3相互作用并抑制其二聚化，從而阻斷IRF3在病毒感染后進入細胞核的過程。YAP缺失可增強IRF3的功能，并促進β干擾素(IFN-β)的表達，在體內和體外均能抑制病毒的復制。此外，該研究還發現YAP獨立于Hippo和LATS1/2調控的新機制，即病毒活化的IKKε能促進YAP的Ser403位點磷酸化，引發溶酶體中YAP降解，使得YAP介導的抑制細胞抗病毒效應減輕。近期，Lv等[37]研究發現，炎癥介質LPS、TNF-α和H2O2可激活TLR4，通過TLR4-MyD88-IRAK1/4-TRAF6-YAP-TAK1-NF-κB系列傳導途徑促進炎癥的發生，而Hippo信號通路中的 YAP蛋白可直接作用于信號傳導通路中的TRAF6，一方面促進TRAF6 K48位點泛素化而使蛋白降解，另一方面抑制K63位點泛素化，從而抑制對下游蛋白TAK1的激活，進而抑制核轉錄因子NF-κB信號通路來減輕炎癥的發生，發揮抗炎作用。Deng等[38]研究發現，關節炎發生時，關節軟骨中的YAP蛋白表達明顯降低，其表達水平隨關節損傷程度的加劇而逐漸降低，其機制與炎性細胞因子TNF-α、IL-1β可加速YAP/TAZ蛋白的降解，抑制YAP/TAZ的轉錄活性有關。同時炎性介質激活Toll樣受體信號通路，TLRs信號通路關鍵分子TAK1可促進YAP/TAZ磷酸化，并促進YAP/TAZ與β-TRCP結合，進而通過泛素化使其降解。此外，該研究也發現YAP可通過抑制NF-κB信號傳導通路以緩解關節炎進程。Boro等[39]研究表明，Hippo通路還參與了結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染機體后的炎性反應。Mtb感染機體后， CCL2、CCL3、CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL15等多種促炎趨化因子表達增加，而敲除MST1/2基因的巨噬細胞經Mtb感染后趨化因子CXCL1/2分泌量不發生顯著改變，由此表明CXCL1/2分泌可受Hippo信號通路MST1/2分子調節，進一步研究發現TLR2識別入侵Mtb抗原后，通過IRAK1/4激活MST1/2，MST1/2活化非經典Hippo通路下游轉錄分子IRF3，進而上調CXCL1/2和抗菌肽的表達。IRF3的活化程度與MST1/2的磷酸化正相關，抑制IRF3活性，CXCL1/2表達受抑制。因此Mtb感染宿主后，可通過TLR2-IRAK1/4-MST1/2-IRF3途徑，誘導促炎趨化因子CXCL1/2分泌和抗菌肽表達，從而保護機體抵抗Mtb病原體損傷。

2.3Hippo信號通路與TGF-β/Smad信號通路 轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是一種多向性、多效性的炎癥細胞因子。在造血細胞、骨折及傷口等部位，機體細胞分泌的非活性TGF-β首先與其Ⅰ型受體(type Ⅰ TGF-β receptor，TβR-Ⅰ)及Ⅱ型受體(type Ⅱ TGF-β receptor，TβR-Ⅱ)結合，形成異源三聚體，三聚體中TβR-Ⅱ磷酸化TβR-Ⅰ，磷酸化的TβR-Ⅰ進而激活受調節的Smads(receptor-regulated Smads,R-Smads)蛋白，將信號傳遞至胞漿。R-Smad作為TGF-β受體的底物被磷酸化后與共同通路型Smads(common-parnter Smads,Co-Smad)結合，成為有轉錄活性的模塊，轉移至細胞核，與靶基因結合，調節蛋白合成，參與創傷修復、免疫功能、細胞增殖、分化、凋亡及纖維化等生物過程的調節[40-42]。與Hippo信號通路一致，TGF-β/Smad轉導通路的活性輸出有賴于其效應蛋白的核轉位。

早期Varelas等[43]研究YAP/TAZ與TGF-β蛋白核質穿梭的相互作用發現，TGFβ刺激人胚胎細胞后，TAZ與細胞內Smads復合物結合，并促進Smads核定位，進而誘導維持人胚胎細胞多能性的基因轉錄，且基因轉錄與TAZ表達水平相關，低水平的TAZ促進核累積，當TAZ濃度增加時，它主要定位于細胞質內，阻斷Smads的核定位，提示Smad蛋白的核累積強烈依賴于TAZ的表達水平和活化狀態。之后，多項研究結果均證實，TGF-β/Smad信號通路與Hippo信號通路存在交聯[44]。活化Hippo通路后，滯留于細胞質內的YAP1/TAZ阻止了Smads的核積累，并限制其轉錄活性。反之，抑制Hippo通路，YAP/TAZ的核轉位則增強核內Smads活性[45]。通過Hippo通路和TGFβ-SMAD信號傳導之間的相互協同，共同參與青光眼的形成、癌癥的發展和轉移、調節組織細胞的穩態、人胚胎干細胞的自我更新及修復等疾病過程[46]。此外，多項研究表明TGF-β信號傳導是心臟、肺、肝、腎和皮膚炎癥纖維化的關鍵調節因子[47-49]。纖維化是由于炎癥導致器官實質細胞發生壞死，組織內細胞外基質異常增多和過度沉積的病理過程。Nishio等[45]研究表明，特異性敲除小鼠肝臟中Mob基因，可導致小鼠細胞增生、伴有炎性細胞浸潤、纖維化、TGF-β表達顯著上調。而抑制肝臟Mob缺陷小鼠的TGF-β受體基因表達，可部分緩解肝臟炎性腫大、纖維化和腫瘤的發生。Fujii等[50]也證實了Hippo信號通路與TGF-β/Smad信號通路存在相互作用，兩條通路的相關蛋白分子可形成 YAP-TEAD-Smad3-p300 復合物，該復合物可被募集到結締組織生長因子(CTGF)啟動子上的推定結合位點，進而提高CTGF基因的表達，促進炎癥纖維化的發展。

2.4Hippo信號通路與G蛋白偶聯受體 G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)含有7個跨膜結構域，該受體通過與G蛋白偶聯介導信號的傳遞。GPCR是介導細胞外信號向胞內傳遞的細胞表面受體中的最大家族，其介導了包括視覺控制、腎臟功能、腫瘤發生、機體免疫調節、炎癥反應等在內多種病理、生理過程的信號傳遞。有研究報道，GPCRs可作為上游調控因子，調節Hippo信號通路的表達[51]。Guan研究團隊通過研究血清對YAP/TAZ磷酸化和激活的影響，以尋找Hippo途徑的上游調節因子。結果顯示，血清中的生物活性磷脂溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇1-磷酸(S1P)可激活G12/13偶聯受體，通過Rho-GTP酶抑制LATS1/2活性，從而誘導YAP去磷酸化和核轉位。此外，激活GPCRs的胰高血糖素、腎上腺素或多巴胺可促進LATS1/2的活化，從而誘導YAP/TAZ磷酸化。Sonika等[52]研究發現，特異性敲除小鼠骨髓G蛋白偶聯受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase2，GRK2)基因，經病原微生物感染膿毒癥后，表現出過度的細胞因子反應，其機制與GRK2對NF-κB1p105-TPL2-MEK-ERK途徑的負調節有關。Nandakumar等[53]研究發現GRK5缺失可抑制組織和巨噬細胞中NF-κB的活化，從而減少細胞因子反應，且動物水平研究顯示GRK5缺陷小鼠胸腺細胞凋亡和免疫抑制減輕。以上研究結果提示GPCR在機體病原菌感染后的炎癥反應中發揮著重要的調節作用，然而GPCR的這些功能作用是否與Hippo通路相關目前尚無文獻報道，有待于進一步深入研究。

3 結語與展望

盡管目前Hippo信號通路的研究取得了迅速而廣泛的進展，但對Hippo信號通路與炎癥疾病的相關性及其作用機制的研究報道并不多，相關研究也多集中于探究通路中的關鍵激酶MST1，MST2和下游轉錄激活分子YAP對免疫細胞和相關信號通路的調節作用，但Hippo信號通路中其他分子如SAV1、LAST1/2和TEAD的相關研究較少。Hippo信號通路對感染性炎癥相關的Toll樣受體信號通路的相互作用的研究較多，且較為深入，但對其他炎癥相關信號通路的調節研究較少。因此，Hippo信號通路對其他炎癥相關細胞的調控，以及Hippo信號通路相關分子與炎癥相關信號通路的相互作用都有待于進一步深入研究。深入剖析Hippo信號通路對炎癥疾病的調控，不但有助于深入闡明炎癥疾病的發病機制，而且可為尋找新的潛在疾病治療靶點提供新契機和思路。