巨噬細胞參與傷口愈合和組織再生的研究進展①

姜 琦 李京蔓 侯亞義

(南京大學醫學院，南京 210093)

巨噬細胞作為一種重要的免疫細胞，能夠在傷口局部大量浸潤，并在傷口愈合過程中發揮關鍵作用[1]。分化的傷口處，巨噬細胞可作為多種表型存在，且呈復雜動態變化及分泌不同種類的細胞因子，從而調控傷口愈合和疤痕形成。由于巨噬細胞幾乎存在于所有組織中，不同組織的傷口修復過程可能具有相似性[2]，由此可以通過巨噬細胞的共同點和特征性將不同組織的修復及愈合相聯系。本文就巨噬細胞參與傷口愈合和組織再生的研究進展進行綜述，并提出與巨噬細胞相關的組織再生策略，基于此可能會對子宮損傷修復提出新的解決方案。

1 巨噬細胞及其表型

巨噬細胞是具有多種功能的免疫細胞，在先天性免疫和獲得性免疫中均發揮重要作用。巨噬細胞能夠通過吞噬作用清除細胞碎片、中性粒細胞、入侵生物體和其他凋亡細胞，除此之外，它還積極調節組織愈合過程[3]。為了執行該功能，巨噬細胞在傷口愈合過程中發展出不同的表型。

傷口處的巨噬細胞是一個異質性細胞群，最常用的分類方法是根據免疫應答中巨噬細胞活化方式的不同將巨噬細胞分為兩類，第一類是經典激活的巨噬細胞，為M1促炎表型，對細菌、IFN-γ、細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和TNF-α有響應[4,5]；第二類是替代性激活的巨噬細胞，為M2抗炎表型，對IL-4、IL-13和IL-33有響應[6]。

M1型巨噬細胞能產生大量促炎細胞因子，如TNF-α和IL-6以及其他促進傷口愈合初始階段的物質，它們具有高度的吞噬功能，能夠吞噬凋亡的中性粒細胞，并且清除傷口中的病原體或碎片[7]。M2型巨噬細胞具有抗炎作用，可通過IL-4、IL-13或凋亡的中性粒細胞進行體外誘導分化產生，它們能夠調節血管再生、成纖維細胞再生、肌成纖維細胞分化和膠原生成[7,8]。除了經典的M1-M2分類系統之外，Murray等[9]提出了新的巨噬細胞分類系統，根據相應的激活物進行命名，即M(IFN-γ)、M(IL-4)和M(IL-10)等。

目前，對于不同的傷口巨噬細胞亞群的成因還存在爭議，主要有以下三種觀點：第一種觀點認為，巨噬細胞可能來源于不同時期招募的具有不同表型的單核細胞，這些單核細胞可分化為具有不同表型的巨噬細胞；第二種觀點認為單核細胞可能在傷口愈合過程中的不同時間被招募，在傷口愈合過程中，不斷變化的傷口微環境會影響到它們的極化；第三種觀點認為M1巨噬細胞可能受局部傷口環境的影響從而分化成M2巨噬細胞[10]。許多研究支持第三種觀點，認為參與調節早期炎癥功能和后期傷口修復功能的是同一群巨噬細胞[10]，這表明傷口局部環境的變化會導致巨噬細胞表型的轉變。然而，并非所有巨噬細胞都適合M1-M2表型的分類標準。最近的研究表明，巨噬細胞的功能不局限于以前的定義，還涉及電傳導、鐵循環、肌成纖維蛋白轉化和突觸修剪等[11-15]。巨噬細胞功能受體液免疫微環境的高度影響，傳統表型分類和分子標記可能不足以充分確定它們在體內的動態作用和行為。可見，我們需要對巨噬細胞的形態、遷移模式及其相鄰細胞組成進行綜合考慮，以獲得對巨噬細胞功能的整體理解。因此，需要對特定微環境中的巨噬細胞進行時間歷程、多重標記、高空間分辨率的體內觀察[16]，有望深刻理解巨噬細胞的分類、功能及行為。

2 巨噬細胞在傷口愈合和疤痕形成中的作用

如前所述，巨噬細胞通過表型分化在傷口愈合過程中發揮了重要作用，下面就巨噬細胞與急性傷口、慢性傷口及疤痕形成的關系三方面進行闡述。

2.1巨噬細胞與急性傷口的關系 巨噬細胞幾乎參與了傷口愈合的所有階段。組織發生損傷后，血小板首先在受傷部位募集，防止受損血管進一步失血。接著，中性粒細胞到達傷口，殺死微生物，并清除細胞碎片[17]。在早期階段，浸潤在傷口局部的巨噬細胞被活化成為M1表型，對所有微生物、基質和血小板的細胞碎片進行吞噬，并分泌促炎介質和趨化因子以招募更多的循環單核細胞[18]。Rasmussen等[19]研究發現，在轉基因斑馬魚中，表達綠色熒光蛋白(GFP)的脊椎動物表皮細胞對損傷后產生的神經元碎片進行吞噬，提示脊椎動物表皮細胞可能是一種具有廣譜-特異性吞噬功能的巨噬細胞。在傷口修復的后期階段，巨噬細胞產生各種細胞因子(如TNF-α)來誘導中性粒細胞凋亡，隨后從M1促炎表型轉換為M2抗炎表型并吞噬凋亡中性粒細胞，以緩解傷口的局部炎癥[16]。Paredes等[20]證明紅色熒光染料(mCherry)標記的巨噬細胞在雙轉基因幼蟲傷口處吞噬了GFP標記的壞死/凋亡粒細胞。

2.2巨噬細胞與慢性傷口的關系 慢性傷口是指3個月或更長時間內未被治愈的皮膚屏障缺損，它不經歷典型傷口修復的四個階段，而是陷入炎癥階段，并進入炎癥和組織破壞的惡性循環[21]。典型的傷口修復的四個階段包括：①血小板介導的止血；②炎癥；③角蛋白細胞增殖和遷移到傷口再上皮化、成纖維細胞遷移、收縮和膠原降解導致瘢痕形成；④傷口血管的清除和瘢痕組織的重塑。慢性傷口往往具有一些共同的特征，包括氧化應激、蛋白酶失衡、生物膜形成或傷口感染、水腫以及延長持續的白細胞募集[22,23]。

與急性傷口不同，慢性傷口中巨噬細胞M1型到M2型巨噬細胞的轉化是失調的[24-26]。在慢性傷口邊緣，大約80%的細胞是M1型巨噬細胞，導致了慢性傷口的持續炎癥最終導致難以愈合或疤痕的形成[24]。Kim等[27]用生物發光成像(BLI)證明，M1促炎巨噬細胞向傷口的運輸增加導致持續性炎癥和傷口愈合受損。糖尿病小鼠的傷口處M2型巨噬細胞水平偏低，導致調節修復增殖階段的生長因子水平降低，如TGF-β1、IGF-1和VEGF，同時具有高水平的促炎性細胞因子和介體，如TNF-α、IL-1β、IL-17和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，不利于傷口的愈合[24,26,28-30]。研究表明，慢性創傷患者的傷口液中存在高水平的促炎細胞因子[24,31]。高水平的促炎介質(如TNF-α)會導致皮膚成纖維細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-3)和基質金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的精細平衡被打破，造成傷口環境中細胞外基質蛋白過度水解，形成慢性傷口[32]。對慢性傷口的理解遠遠落后于急性傷口的部分原因可能是缺乏一種能充分概括人類病理的動物模型。

2.3巨噬細胞調節疤痕形成的機制 疤痕形成是傷口異常愈合的最終結果，受傷口愈合中纖維化、疤痕膠原沉積、血管生成等因素綜合影響，并伴隨疼痛、硬化或纖維化等癥狀，大面積的疤痕甚至會導致一些細胞或部位的功能喪失，從而影響正常生理活動。巨噬細胞在疤痕的形成過程中發揮重要作用。新生的PU.1基因敲除小鼠是一種完全缺乏巨噬細胞的動物模型，研究發現這種模型小鼠與對照小鼠以相同的速度修復皮膚，但疤痕形成卻大大減少，這表明巨噬細胞調節疤痕形成[33]。利用白喉毒素驅動的溶菌酶M特異性消融術或CD11b特異性細胞系消融術選擇性地清除所有巨噬細胞表型的結果也表明，巨噬細胞對傷口愈合是必要的，并且調節疤痕形成[34-36]。事實上，最早研究巨噬細胞在修復中的作用時，使用抗巨噬細胞血清耗盡這些細胞就顯示出了創傷修復的受損[37]。最近的研究證實并擴展了這些發現，表明在整個修復過程中特定的巨噬細胞消除會導致再上皮化和傷口收縮延遲，膠原沉積減少，血管生成受損，以及愈合傷口中的細胞增殖減少[35]，有助于減少瘢痕形成。

疤痕形成是傷口愈合不良的結果，目前的疤痕治療方法還是以傳統治療方法為主，如敷料、局部治療、外科修復、注射處理、壓力療法、激光等，治療人類疤痕和其他纖維化疾病的有效新型藥物還有待開發研究[38]。子宮內膜嚴重損傷會導致宮腔黏連，正常結構性細胞的增殖分化異常，大量的纖維組織替代，而目前宮腔黏連的主要治療方法是手術分離，但該方法無法解決內膜瘢痕化。迄今的發現已表明，傷口巨噬細胞在傷口修復中起著難以替代的特殊作用，未來研究若著眼于調整異常修復條件中的巨噬細胞，可能會得到更為有效的緩解或治療傷口愈合不良及疤痕形成的新方法。

2.4巨噬細胞參與不同組織的傷口愈合 巨噬細胞存在于所有組織中，不同組織中巨噬細胞促進傷口愈合的過程具有組織特異性，但也具有共性[39]。通過充分了解巨噬細胞差異與共性可以確保適當的修復，或通過調整系統免疫功能輔助損傷部位的巨噬細胞進行修復，可能是治療不良修復導致疾病的重要機遇。

大量研究表明M(IL-4)巨噬細胞在組織修復中發揮重要作用。有研究證明小鼠直到出生后7 d可以再生心臟組織，主要依賴于單核細胞和巨噬細胞[40]。M(IL-4)被認為是主要的組織修復巨噬細胞，表達多種傷口愈合因子，如精氨酸酶、細胞外基質成分和生長因子[如VEGF-A、血小板衍生生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(IGF)][3,8,41]。在缺乏M(IL-4)的小鼠中，皮膚傷口愈合延遲，血管穩定性受損[42]。對皮膚和肺組織修復過程的研究表明，M(IL-4)的作用可能在組織形成階段最為突出，有助于細胞增殖、成纖維細胞的調節、膠原蛋白的產生和交叉連接，并具有廣泛的抗炎功能。相對于皮膚內傷口修復的不同階段，肺部巨噬細胞參與的組織形成階段是提前的，這種傷口修復的快速開始可能是肺泡巨噬細胞本身已經傾向于傷口修復相關亞型的結果。有研究認為肺部通過提供促炎性細胞因子，增加肺泡巨噬細胞的激活閾值，從而在肺中留下特有的耐受反應，顯著促進肺泡巨噬細胞的表型轉換。皮膚組織中的傷口修復主要集中在皮膚完整性的恢復上，但是原有皮膚結構的許多方面及其高度分化的區域化并沒有被重建。相比之下，即使在嚴重損傷或手術切除部分肺葉后，肺組織仍具有顯著的再生能力，可導致肺泡結構的恢復[43,44]。由此可見，不同組織具有獨特再生能力，而巨噬細胞在其中的特征性作用不可忽視。

Godwin等[45]發現巨噬細胞被系統性去除后，蠑螈無法再生肢體，而是形成瘢痕組織。對免疫信號進行綜合性分析，發現巨噬細胞浸潤是蠑螈肢體再生所必需的。具體地說，蠑螈保留了許多哺乳動物細胞因子/趨化因子的信號特征，在截肢后最初的24 h以內，蠑螈的免疫系統同時啟動了炎癥和抗炎癥應答。在這一階段系統性去除巨噬細胞，會導致傷口閉合，肢體再生失敗，這一現象伴隨有廣泛的纖維化。之后恢復蠑螈體內的巨噬細胞，并再次進行截肢，發現蠑螈的再生能力得到完全恢復。

肌成纖維蛋白轉化是傷口愈合過程中疤痕形成的主要原因，也是慢性或急性損傷(如肝纖維化、腎纖維化和肺纖維化)時器官組織纖維化的主要原因[46]。細胞譜系追蹤研究表明，巨噬細胞可以在人體和實驗性纖維化過程中不同程度地轉化為肌成纖維細胞[14,47-48]。雖然巨噬細胞-肌成纖維細胞轉化(macrophage-to-myofibroblast transition，MMT)的機制仍在研究中，但已明確標志著MMT的關鍵步驟是巨噬細胞產生膠原。活體內二次諧波和雙光子激發熒光(SHG/TPEF)顯微術可以監測這一關鍵過程，并可能為將來體內MMT提供更多的可視化證據。MMP12是一種具有彈性蛋白酶活性的金屬彈性蛋白酶，在各種損傷模型下可調節傷口愈合過程中的纖維化[49]。Chan等[50]通過活體成像證明，在傷口修復過程中MMP12對角膜疤痕的產生有抑制作用。結果顯示MMP12小鼠角膜損傷中EGFP標記的髓系細胞(巨噬細胞)的浸潤增多，釋放的MMP12增多，從而減弱角膜肌成纖維蛋白轉化和血管生成反應，以避免在傷口修復過程中出現纖維化。通過提高MMP表達，巨噬細胞亞群在修復肝和肺的炎癥和纖維化中的作用有明顯提高[51]，其中Ly6ChiF4/80IntCD11bhi巨噬細胞被鑒定為負責重塑肝疤痕的恢復性巨噬細胞[52]。另外，血吸蟲病中的一種寄生蟲感染能夠引起慢性損傷和炎癥，并導致不可逆的纖維化，M2型巨噬細胞能夠控制該病產生炎癥和疤痕，從而減緩致死纖維化的發展。這些M2巨噬細胞來源于LysMloF4/80hiCD11bhiIL-4Ra+巨噬細胞[42]。這些研究提示，疤痕修復研究也許可以從多個器官修復之間的共性入手，找到更為有效的治療方法。

局部炎癥消退是恢復組織穩態的關鍵步驟。傷口巨噬細胞可能通過局部凋亡、遷移到淋巴結和脾臟等多種途徑被清除[53]。前面的證據表明巨噬細胞是傷口愈合的關鍵調控因素[49,55]，進一步對其研究可能為避免傷口愈合中疤痕的形成提供治療方法。

3 巨噬細胞與子宮損傷修復的關系

前文具體介紹了巨噬細胞在傷口愈合和疤痕形成中的重要作用，其中包括巨噬細胞參與不同組織傷口修復的機制，而巨噬細胞參與子宮損傷修復的研究尚淺，因此可以通過研究巨噬細胞參與其他組織傷口愈合的機制進而為研究子宮內膜修復中巨噬細胞的作用提供有力參考，結合子宮內膜巨噬細胞的特性，有可能提出以巨噬細胞為靶點的子宮內膜重建的新策略。

蛻膜組織是子宮內膜間質的一種特殊組織，它對于妊娠的建立和維持至關重要。目前認為，蛻膜巨噬細胞是人類妊娠期子宮內抗原呈遞細胞的主要亞群，位于滋養層侵入和妊娠早期螺旋動脈重塑期間的螺旋動脈附近，在血管重構中起著重要作用。對于人類來說，巨噬細胞占妊娠期蛻膜白細胞的20%～30%，其數量隨孕齡而變化[56]。在受精卵著床期間，蛻膜巨噬細胞大多為M1表型。隨后滋養層附著在子宮內膜內層并侵入子宮基質時，它們開始轉變成M1/M2型混合的狀態[57]。這種混合極化模式通過子宮血管重塑過程來維持，從而在妊娠早期和妊娠中期建立足夠的胎盤-胎兒血液供應[58]。胎盤發育完成后，蛻膜巨噬細胞表型發生轉變，以M2表型為主，以防止胎兒被母體排斥，并允許胎兒生長直至分娩。正常妊娠期的蛻膜巨噬細胞主要為M2型極化，通過產生基質金屬蛋白酶、血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子和IL-10等多種因子，在血管生成、螺旋動脈重塑、絨毛外滋養層侵入和免疫調節等方面發揮重要作用。而在病理妊娠期間，蛻膜M1巨噬細胞數量增加，分泌破壞性的促炎因子，如TNF-α、一氧化氮和IFN-γ[59]，影響血管生成、組織內穩態、滋養層侵襲、螺旋動脈重塑以及胎盤發育，導致一系列妊娠疾病，包括先兆子癇、胎兒生長受限和死胎。

總之，巨噬細胞作為妊娠早期第二大蛻膜白細胞群，通過清除凋亡細胞碎片、細胞外基質分子和細胞因子的分泌、抗原呈遞功能，在組織重塑中起著重要作用，有助于母胎免疫耐受的建立[60]。異常活化的蛻膜巨噬細胞可能導致一系列妊娠疾病。研究蛻膜巨噬細胞對建立正常和異常的胎盤-胎兒界面的作用，可以更好地了解妊娠疾病的發病機制，尋找這些疾病的新治療靶點。另外，研究子宮內膜中巨噬細胞與T細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)等其他免疫細胞互相作用的機制，可以為子宮損傷修復提出新的解決方案。

4 巨噬細胞的調控與組織再生的策略

巨噬細胞除了具有吞噬細胞碎片、外來病原體和凋亡細胞的作用，還積極參與傷口愈合與組織再生過程(主要是M2型巨噬細胞)[3]。通過生物材料和藥物輸送系統調節免疫系統中巨噬細胞表型，使其向M2型極化，也許能夠成為一種促進組織再生的治療策略(圖1)。

研究生物材料理化性質對巨噬細胞的調控方式具有重要價值。生物材料交聯是其中的一種重要的方式，高交聯水平的支架通常會對巨噬細胞表型轉換產生影響[61，62]。已經證明，植入大鼠體內的碳化二亞胺交聯形式的小腸黏膜下層會優先誘導促炎巨噬細胞，而未處理的黏膜下層則主要誘導抗炎巨噬細胞。巨噬細胞黏附和細胞因子分泌還受到表面化學的影響。例如，與疏水表面相比，盡管親水/中性表面上的巨噬細胞較少，但巨噬細胞被進一步激活，產生的細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8和IL-10)明顯增多。有關巨噬細胞極化作用的形態學研究表明，刺激巨噬細胞伸長有利于促進抗炎極化[63]，這可以通過微模式化表面和控制附著來實現，也可以通過表面上的巨噬細胞配體促進細胞的伸長來實現[61]。

圖1 基于生物材料和藥物輸送系統設計促進組織再生的治療策略Fig.1 Therapeutic strategies for tissue regeneration based on biomaterials and drug delivery systems

危險信號和促炎細胞因子引起的炎癥是啟動組織愈合的必要條件[64]。基質細胞延伸因子-1(SDF-1)是一種炎性和促血管生成的趨化因子，已被證明在組織愈合過程中非常重要，特別是其調動祖細胞的能力[65]。大量的研究已經使用生物材料，如絲膠原、明膠、海藻酸鹽、聚乙二醇化纖維蛋白等，作為載藥系統結合SDF-1來治療組織損傷，這種策略的有效性已在肌腱、心肌、皮膚和肝臟模型中得到證實[65-68]。這種生物材料可以用于招募CXCR4+細胞，包括巨噬細胞、造血干細胞和MSCs并增加血管生成[65，69]。然而，SDF-1治療策略的限制因素之一是它對蛋白酶的敏感性，容易被MMP-2和絲氨酸外肽酶CD26降解。可以通過修改SDF-1上面的MMP-2/CD26裂解位點或用共傳遞酶抑制劑來克服[65]。限制因素之二是較高劑量的SDF-1會促進巨噬細胞驅動的增生性瘢痕形成[61]。因此，在設計治療方案時，SDF-1劑量的選擇非常重要，以避免纖維化的發生。

雖然組織損傷部位的炎癥是啟動愈合反應所必需的，但消退炎癥對于促進愈合過程和恢復組織完整性至關重要。巨噬細胞的促炎功能在炎癥的早期階段是必不可少的，但是適當的組織愈合需要巨噬細胞及時轉化為抗炎表型。巨噬細胞的促進炎癥消退的活性主要體現在Tregs的形成和維持。Tregs能創造一個有利于組織修復的抗炎環境，并有助于維持巨噬細胞的抗炎表型[70]。促進巨噬細胞從促炎狀態到炎癥消退狀態轉變的治療策略可以改善愈合過程。例如，一種基于消退素(resolvins)的策略已經被證明能夠通過增強腹膜炎的消退來促進肥胖糖尿病小鼠的傷口愈合[71]。同樣，在糖尿病小鼠的傷口上給予保護素(protectins)也改善了再上皮化和肉芽組織的形成以及神經支配[72]。注射消退素和脂氧素(lipoxins)也被證明能夠控制殼聚糖支架植入后誘導的巨噬細胞極化[73]。Maresins由內源性二十二碳六烯酸通過活化的巨噬細胞轉化而成，是一個有效的抗炎家族，能夠促進炎癥消退[74]。M(IFN-γ)巨噬細胞通過釋放TNF-α等細胞因子引起炎癥，在某些情況下被證明能積極調節組織修復和再生，但過量會損害愈合過程。常用止痛藥，例如阿司匹林、布洛芬和己酮可可堿，可抑制巨噬細胞釋放TNF-α，起到抗炎作用[75-77]。使用透明質酸作為TNF-α單克隆抗體的運載工具，對誘導燒傷后大鼠的早期愈合是有效的[78]。抗炎細胞因子(如IL-10)參與促炎巨噬細胞到抗炎巨噬細胞的轉換，對于組織修復和再生是至關重要的[3]。小鼠模型證明IL-10參與無疤痕愈合，胎兒小鼠能夠通過IL-10依賴機制修復皮膚損傷并不產生疤痕，這種能力可以在過表達IL-10的成年小鼠身上也有所體現[79]。有研究表明，利用以肝素為基礎的凝聚層作為IL-10的傳遞載體，能夠顯著降低小鼠心肌梗死后的纖維化程度[80]。

共傳遞生長因子和免疫調節劑也可以應用于組織修復。例如，富含血小板的血漿(PRP)中含有高水平的生長因子，可以在L-乳酸接枝明膠中與含有鞘氨醇-1-磷酸激動劑(SEW2871)的巨噬細胞吸引膠束一起輸送，以增加小鼠的骨再生[81]。有趣的是SEW2871膠束和PRP在使用3 d后提高了TNF-α的水平，并在第10天增加了抗炎細胞因子IL-10。使用相同的系統，SDF-1與SEW2871膠束共輸能夠使小鼠皮膚傷口閉合率增加一倍以上。其可能的原因是SDF-1/SEW2871組合能夠將MSC和巨噬細胞招募到受損皮膚中[82]。

不同的免疫細胞和免疫調節劑參與組織愈合過程的各個階段，通過調控免疫系統，特別是關鍵免疫細胞亞群，是促進組織再生的一個合理策略。但是免疫系統調節各種器官和組織修復的機制仍需深入研究。巨噬細胞在組織愈合過程的大多數階段都是至關重要的，但其改變表型促進組織再生和纖維化的機制尚不完全清楚，需要進一步的研究。

5 結論與展望

巨噬細胞在傷口修復過程中發揮著至關重要的作用。促炎M1表型更常見于修復的早期階段，到傷口愈合的后期是促修復的抗炎M2表型。兩者之間有一個過渡態時期，巨噬細胞表達混合M1/M2表型。失控的炎癥和巨噬細胞表型的異常是阻礙傷口閉合的主要原因。巨噬細胞參與了組織愈合過程的大多數階段，我們可以利用生物材料和藥物傳遞系統傳遞各種免疫調節劑，以刺激巨噬細胞向促修復亞型極化或招募傷口愈合前的巨噬細胞亞群，從而發展再生策略。更好地了解巨噬細胞在病理進程中的功能和作用將為傷口愈合和組織修復的診斷、預后評估和治療干預提供新的啟示，并為子宮損傷修復開拓新思路。