洛伐他汀對小鼠主動脈血管內皮生長因子表達的影響

諶宇翔 譚志堅 歐輝躍

【摘要】目的：研究洛伐他?。↙ovastatin，LOV）對小鼠主動脈內皮生長因子（endothelial cell-derived growth factor， VEGF）表達的影響。方法：成年昆明小鼠24只，隨機分為對照組、給藥組（LOV低、高濃度）3組，每組8只小鼠。將1mg/ml的鹽酸腎上腺素用0.9%生理鹽水稀釋1.5倍，于每日的8∶00 am、12∶00am、4∶00 pm對三組都予以皮下注射，鹽酸腎上腺素0.05 ml/100 g，連續5天，建立內皮損傷模型。建模成功后，各組小鼠分別給予洛伐他?。?、15mg/Kg）進行灌胃，對照組給予0.3ml生理鹽水灌胃。六周后免疫組化檢測小鼠主動脈VEGF的表達。結果：灌胃6周后，免疫組化顯示，與對照組相比，給藥組小鼠主動脈VEGF表達明顯增強，且濃度越高，VEGF表達越強。結論：LOV通過促進VEGF的表達改善和治療內皮損傷，LOV對小鼠主動脈內皮損傷后VEGF的表達具有促進作用。

【關鍵詞】洛伐他汀 ?主動脈內皮損傷 ?血管 ?內皮生長因子

引言：內皮損傷被認為是血管壁內的動脈粥樣硬化 （athero-

sclerosis， AS）發生發展的早期啟動因素 。而洛伐他汀屬于調整血脂藥， 是臨床上常用的降血脂、預防心腦血管疾病的藥物。他汀類藥物對血管內皮損傷也有明顯的改善作用 。但是其機制尚不明確。本實驗通過觀察洛伐他汀對小鼠主動脈內皮損傷后VEGF表達的影響，初步探討洛伐他汀可能的機制。

一、材料與方法

（一）藥物試劑與儀器

成年昆明小鼠24只，雌雄各半，鹽酸腎上腺素，戊巴比妥鈉，VEGF免疫組化S-P試劑盒，HE染色試劑盒，洛伐他汀，生理鹽水等

（二）動物分組及模型制備

隨機選取16只小鼠作為給藥組，8只作為對照組。將1 mg/ml的鹽酸腎上腺素用0.9%生理鹽水稀釋1.5倍，三組小鼠均于每日的8∶00 am、12∶00am、4∶00 pm在皮下注射稀釋后的鹽酸腎上腺素0.05 ml/100 g，連續5天，自第4天起每二次給藥中間時間將小鼠放入0℃的冰水中冰泳5 min，共4次。

（三）病理學標本制備

60℃烤片12h;切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，100%，95%，85%和75%乙醇，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min;蘇木素染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍;伊紅染3～5min，蒸餾水沖洗;梯度酒精（95-100%）脫水，每級5 min（或者直接把片子烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

（四）免疫組化檢測VEGF的表達

60℃烤片12 h;切片脫蠟至水：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min;熱修復抗原：將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，連續煮20min后，冷卻10min后拿出，冷卻至室溫。冷卻后0.01M PBS（pH7.2～7.6）洗滌3 min x 3次;加入1%高碘酸，室溫20 分鐘以滅活內源性酶。PBS沖洗3 min x 3次;孵育一抗：滴加適當稀釋的一抗（VEGF），4℃過夜。PBS沖洗5 min x 3次;孵育二抗：滴加50～100 μL抗-小鼠-IgG抗體-HRP多聚體37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min x 3次;DAB顯色： 滴加預制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min， 鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌;蘇木素復染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍;各級酒精（60-100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

二、結果

于第6天晨，分別任意抽取對照組、給藥組各2只小鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（4.5 mg/100 g），取主動脈HE染色觀察。結果顯示造模成功。造模成功后，將給藥組的14只小鼠隨機分為洛伐他汀低、高（5、15 mg /kg）兩個劑量組。除通過灌胃灌進不同劑量的洛伐他汀外，其余條件皆與對照組相同。6周后測量大鼠主動脈VEGF的表達，結果顯示與對照組（圖A）相比，給藥組（圖B、C）VEGF表達明顯增強，且與洛伐他汀低劑量組（圖B）（5mg/kg）相比，洛伐他汀高劑量組（圖C）（15mg/kg）表達更強。

三、討論

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性、進行性、多因素的系統性疾病，是心腦血管疾病的病理基礎。有文獻指出，血管內皮損傷是動脈硬化的最初使動因素，動脈硬化患者早期的表現就是內皮損傷，內皮細胞功能不全。功能紅曲有效成分洛伐他汀（Lovas-tatin）是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，具有降低膽固醇、調節血脂作用。

洛伐他汀除了具有顯著的降血脂效果外，還能明顯地改善內皮細胞的功能、抗炎和抗增殖，促進一氧化氮合成酶（eNOS）的產生，從而增加NO的合成和釋放，這對血管內皮有著許多積極意義。多項研究指出， 他汀類藥物在降低血脂及心血管事件中有良好的預防和治療作用。另有研究表明他汀類藥物對機體一些部位VEGF的表達有促進作用。VEGF是一種特異性較高的血管內皮生長因子，能影響內皮細胞的功能，在加重和形成AS方面發揮重要作用。但綜合已知文獻，目前對于他汀類藥物預防和治療機制的研究尚不是很明確。

本實驗通過觀察洛伐他汀對小鼠主動脈內皮損傷后VEGF表達的影響，初步探討洛伐他汀可能的機制。免疫組化實驗結果顯示，與對照組相比給藥組VEGF表達明顯增強，且與洛伐他汀低劑量組（5mg/kg）相比，洛伐他汀高劑量組（15mg/kg）表達更強。綜上所述，LOV通過促進VEGF的表達改善和治療內皮損傷。LOV對小鼠主動脈內皮損傷后VEGF的表達具有促進作用。

本次實驗的不足：由于經費有限，本次實驗只設置了高低兩個劑量組并未設置更多的劑量梯度，因此無法進行更加細致的比較。另外本次實驗只是對造模第6天、灌胃6周的小鼠后進行HE染色取材觀察，灌胃六周后的小鼠進行了免疫組化觀察，因此只能了解始末的變化，無法細致的了解其中間的變化過程，下一步實驗可以做與此相關的進一步研究或者他汀類藥物對不同組織如睪丸，腦組織等損傷后VEGF表達的影響。

參考文獻：

[1]Uemura Y， Shibata R， Kanemura N， et al.Adipose-derived protein omentin prevents neointimal formation after arterial injury[J].FASEB J，2015，29（1）：141.

[2]孫麗靜，白麗華，趙惠.不同劑量洛伐他汀治療冠心病伴高脂血癥的臨床觀察[J].臨床合理用藥雜志，2014，7（04）：31-32.

[3]黃寧江，吳樹金，楊旭紅，劉立英.洛伐他汀對HTL損傷血管內皮功能的保護作用及機制探討[J].中南藥學，2009，7（01）：17-20.

[4]趙建宏，林琳，高繼發，曹卉，朱凡河，毛慶波.SD大鼠血管內皮細胞損傷模型的制作方法[J].微循環學雜志，2000（02）：20-21+0-58+61.

[5]劉勇，劉艷麗，張利鋒，巫少榮.從脾論治頸動脈粥樣硬化的臨床探討[J].泰山醫學院學報，2019，40（10）：764-765.

[6]黃珮，毛小冬.頸動脈硬化癥與高同型半胱氨酸血癥的關系研究[J].實用臨床醫藥雜志，2013，17（21）：151-152.

[7]楊鐵勇，李霞.高同型半胱氨酸血癥與冠狀動脈粥樣硬化[J].中國社區醫師（醫學專業），2011，13（14）：6-7. DOI：10.3969/j.issn.1007-614x.2011.14.004.

[8]Alsulaimani S， Gardener H， Elkind MS， et al.Elevated homocysteine and carotid plaque area and densitometry in the Northern Manhattan Study[J].Stroke， 2013， 44 （2） ：457.

[9]Endo A. Monacolin K， a new hypocholesterolemic agent pro- duced by Monascus species [J]. J Antibiotics， 1979， 32（8）： 852-854.

[10]Ozaki K，YamamotoT，Ishibashi T，etal.Regulation of endothelial nitric oxide synthase and endothelial-1 expression by fluvastatin in human vascular endothelial cells[J].Jpn J Pharmacol，2001，85（2）：147-154.

[11]何勁松，錢敏，蔣春明.洛伐他汀對大鼠腎系膜細胞增殖和細胞外基質分泌的影響[J].中國生化藥物雜志，2003（06）：289-292.

[12]侯衛靜，王慶勝，張晶.他汀類藥物對低密度脂蛋白膽固醇正常的動脈粥樣硬化人群的干預作用[J].醫學綜述，2016，22（06）：1141-1145.

[13]賴誠民，陳勇.他汀類藥物對老年冠心病患者動脈粥樣硬化程度的影響[J].中國老年學雜志，2015，35（16）：4507-4509.

[14]李成義，薛曉艷，鄭魏，高峰，饒芝國.阿托伐他汀對大鼠腦出血后血腫周圍血管內皮生長因子表達的影響[J].國際藥學研究雜志，2013，40（04）：481-484+490.

[15]施巍，王丙聚，宋輝.有氧運動用于動脈粥樣硬化大鼠對VEGF、ET-1及C/F值影響的實驗研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2019，18（19）：2045-2049. DOI：10.3969/j.issn.1671-4695.2019.19.009.

基金項目：長沙醫學院大學生研究性學習與創新性實驗計劃項目（長醫教[2018]77號-252）。