蝎毒耐熱蛋白對(duì)癲癇大鼠海馬組織BDNF及NPY表達(dá)的影響

陳其鉆 楊朋范 鐘忠輝 林 巧 梅 珍 裴家生 王守森

全蝎用于治療癲癇、驚厥在中國已有幾千年的歷史。研究表明蝎尾中的蝎毒具有明顯的抗癲癇、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、促纖溶等作用[1，2]，其主要成分是蝎毒耐 熱 蛋 白（scorpion venom heatresistant protein，SVHRP）。癲癇急性發(fā)作期，常伴有海馬組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）的表達(dá)上調(diào)，而通過抑制BDNF 的酪氨酸激酶受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并增強(qiáng)NPY 表達(dá)可能是癲癇潛在治療方法，尤其是顳葉癲癇[3]。本研究探討SVHRP對(duì)癲癇大鼠海馬組織BDNF及NPY表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組 健康成年雄性SD 大鼠180只，按隨機(jī)區(qū)組法隨機(jī)分為3 組（SVHRP 組、模型組、正常組），每組60 只動(dòng)物。①SVHRP 組：制作癲癇模型后，每天同一時(shí)間腹腔注射一次SVHRP，連續(xù)10 d。②模型組：癲癇模型制作后，每天同一時(shí)間腹腔注射與治療組等體積的生理鹽水，連續(xù)10 d。③正常組：不制作癲癇模型，連續(xù)10 d，每天同一時(shí)間腹腔注射與治療組等體積的生理鹽水。

1.2 癲癇模型的制作 暴露頸部皮膚，經(jīng)頸部皮下注射FeCl2誘發(fā)癲癇急性發(fā)作，選取4～5級(jí)（Racine的癲癇分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）癲癇發(fā)作的大鼠。

1.3 HE 染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué) 乙醚麻醉后，冰上斷頭處死大鼠，分離雙側(cè)海馬組織，吸水紙吸去表面血漬，4%多聚甲醛浸泡、固定24 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等操作后，制備5.0 μm厚度的海馬組織石蠟切片，行常規(guī)HE染色。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)海馬組織BDNF、NPY蛋白的表達(dá) 在裂解緩沖液添加苯甲基磺酰氟用于提取大鼠海馬組織總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上；沖洗3 次后，置于含5%脫脂牛奶的含吐溫-20磷酸鹽緩沖液室溫封閉2 h；按1：1 000比列加入兔抗小鼠BDNF抗體、兔抗小鼠NPY抗體、兔抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白抗體4 ℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液洗膜3次，加入1：5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h；含吐溫-20磷酸鹽緩沖液洗膜，化學(xué)發(fā)光法成像分析免疫條帶，凝膠電泳圖分析軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值，兩者之比則可表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 熒光免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)海馬組織BDNF 及NPY的表達(dá) 多聚甲醛固定24 h，經(jīng)脫水、透明、包埋等過程，制備5.0 μm厚度的海馬組織石蠟切片，兔抗小鼠BDNF 抗體、兔抗小鼠NPY 抗體、兔抗小鼠βaction抗體進(jìn)行免疫熒光一抗孵育，使用Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗來為β-action 抗原顯色，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔二抗來為BDNF、NPY 顯色，熒光顯微鏡下觀察切片組織形態(tài)，采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析；計(jì)量資料采用表示，采用單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、Dunnett-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用Fisher精確概率法檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 海馬組織病理形態(tài)學(xué)改變 正常組大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊，胞漿淡染，輪廓完整，無周圍組織細(xì)胞水腫（圖1A）；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂，間隙增寬、數(shù)量減少，胞體變形、縮小，胞漿濃縮深染，出現(xiàn)核固縮、碎裂、溶解（圖1B）；SVHRP 組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損害情況有明顯好轉(zhuǎn)，雖細(xì)胞排列依舊紊亂，間隙相對(duì)較大，細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞深染等，但變形、深染細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞碎片明顯減少，可觀察到正常細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1C）。

2.2 SVHRP 對(duì)海馬組織BDNF、NPY 表達(dá)的影響 免疫印跡法檢測(cè)可見模型組和SVHRP 組大鼠海馬組織BDNF 及NPY 表達(dá)水平均明顯低于正常組（P＜0.05，圖 2），而 SVHRP 組 BDNF 及 NPY 表達(dá)水平明顯高于模型組（P＜0.05，圖2）。免疫熒光定量分析結(jié)果顯示，模型組和SVHRP組熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯減弱（P＜0.05，圖3、表1），而SVHRP組大鼠海馬組織熒光強(qiáng)度較模型組明顯增高（P＜0.05，圖3、表1）。

3 討論

癲癇的病因及癥狀復(fù)雜多變，治療仍以控制癲癇急性發(fā)作為主。由于癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，為控制癲癇反復(fù)發(fā)作，需長(zhǎng)期服用大量的抗癲癇藥物，不僅給病人家庭帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且對(duì)自身身心及意志都是極大的摧殘。有研究證實(shí)，蝎尾中提取的SHRPV不僅能夠降低癲癇反復(fù)發(fā)作敏感性，而且對(duì)癲癇反復(fù)發(fā)作也有明顯治療功效。但是，由于SVHRP 富含神經(jīng)毒素，成分較為復(fù)雜，藥用成分分離、純化困難，限制了其在抗癲癇中的應(yīng)用。

圖1 SVHRP 對(duì)癲癇大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響（HE，×40）

圖2 SVHRP 對(duì)癲癇大鼠海馬組織BDNF 和NPY 蛋白表達(dá)的影響

圖3 SVHRP對(duì)癲癇大鼠海馬組織BDNF和NPY蛋白表達(dá)的免疫熒光染色（×400）

表1 SVHRP 對(duì)癲癇大鼠海馬組織BDNF 和NPY 蛋白表達(dá)的免疫熒光染色定量結(jié)果

BDNF 增加可以相應(yīng)地誘導(dǎo)NPY 高表達(dá)，后者能對(duì)抗BDNF在癲癇發(fā)生、發(fā)展中的負(fù)面作用[7]。在匹羅卡品所致海馬腦片的癲癇模型中，癲癇放電后即出現(xiàn)BDNF 的增高，且隨之出現(xiàn)NPY 的增加，二者保持了時(shí)間上的一致性[8]。NPY 基因過度表達(dá)能在遺傳性全面性失神發(fā)作的癲癇大鼠模型中產(chǎn)生持續(xù)的抗癲癇作用，NPY 基因治療可能是治療遺傳性全面性癲癇的一種新方法[9]。在大鼠頸部皮下注射NPY，發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠癲癇發(fā)作癥狀的頻率、持續(xù)時(shí)間、發(fā)放幅度均有不同程度緩解[10]，進(jìn)一步證實(shí)NPY具有顯著的抗癲癇作用。

總之，本文結(jié)果表明SVHRP 干預(yù)可明顯上調(diào)FeCl2誘導(dǎo)的癲癇大鼠癲癇海馬組織BDNF、NPY 蛋白表達(dá)。然而，是否可以通過外源性給予BDNF 或NPY，改善癲癇癥狀，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。