miR-21作用于PTEN 與結腸癌化療療效關系*

劉 潔 彭 微 劉 懷 徐筱紅 李媛彬 羅庚求

1 湖南中醫藥高等?？茖W校基礎醫學部，湖南省株洲市 412000； 2 中南大學湘雅醫學院病理學系

結腸癌是我國最常見消化道腫瘤之一，隨著飲食習慣的改變，近幾年來結腸癌的發病率與死亡率逐年上升，且越來越年輕化。近年來miRNA的研究已成為腫瘤學領域的新熱點，國內外多項研究表明在結腸癌患者組織miR-21呈高表達，并其表達與臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移相關，揭示miR-21作為一個致癌miRNA，在腫瘤的發生和發展中起著重要的作用[1-2]。

目前治療惡性腫瘤的主要手段仍然是手術和化療，但是有部分患者對化療藥物不敏感，從而使化療的療效不明顯。因此，提高惡性腫瘤對化療藥物的敏感性已經成為腫瘤研究一個重要方面，也是提高化療療效的主要方法。多項研究表明在多種腫瘤中包括結腸癌中miR-21高表達與治療療效不佳、預后差顯著相關，抑制腫瘤細胞中miR-21的表達可增強腫瘤細胞對放化療的敏感性。而我們前期研究也證實結腸癌晚期患者血漿中 miR-21 表達水平不同對化療藥物的療效也不相同，提示血漿 miR-21 有望成為預測化療藥物療效的敏感性指標。另外在多種癌中，已證實miR-21作用于靶基因PTEN，在轉錄后水平調節腫瘤細胞的擴散及侵襲[3]。同時miR-21通過作用于其靶基因PTEN在許多腫瘤細胞的耐藥中發揮作用[4]。

因此，我們在前期已有工作基礎上從臨床和細胞學兩個方面進行研究，旨在提示結腸癌中miR-21和PTEN聯合檢測可成為有效的輔助預測化療療效的敏感指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集:經醫院倫理委員會審查通過收集株洲市中心醫院經病理組織和影像學檢查診斷為Ⅲ期結腸癌患者40例，其中男24例，女16例，年齡45～75歲，中位年齡58歲。這40例患者術前均未接受過任何治療。在患者填寫知情同意書后，采集這40例結腸癌患者化療前的病理組織切片。所有患者入院后進行FOLFOX4方案化療，化療方案每2周重復10次，6個周期化療后進行療效評估。

1.1.2 細胞來源：結腸癌細胞株SW480(中國科學院上海細胞庫)。

1.1.3 試劑：10%小牛血清的RPMI-1640、DMEM培養基(Gibco公司)；Lipofectamine TM 2000轉染試劑(美國Invitr-ogen公司)；引物及U6內參(上海生工生物工程公司)；總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)；qPCR QuantitationKit試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；PTEN抗體(美國Cell Signaling公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗、兔抗人β-actin(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測結腸癌組織miR-21表達：按試劑盒說明進行逆轉錄反應，然后開展熒光定量PCR。所有標本檢測3次。以U6作為內參基因。

1.2.2 免疫組化測定PTEN表達：用已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。PTEN 表達于細胞核或質中，按照每個視野中陽性細胞數占全部細胞數的比例將判斷標準分4級：≤10%為-，> 10%且≤50%為+，>50%且≤75 %為++，>75%為+++。

1.2.3 細胞的分組及處理：對數增殖期的SW480細胞，用濃度(0.06μg/ml)作用48h后棄去含藥的培養液，加入新鮮的培養液,繼續培養：待其恢復正常，消化傳代后繼續用0.06μg/ml的藥物濃度處理48h，如此反復，每個濃度重復3～5次,然后提高濃度梯度，最終使細胞耐受濃度為0.8μg/ml，并將該株細胞始終處于0.8μg/ml順鉑作用下，以穩定耐藥性能；細胞轉染步驟如下：SW480細胞經過0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數增殖期細胞2×105個接種于6孔板，用250μl無血清RPMI-1640稀釋LipofectamineTM2000轉染試劑8μl和miR-21抑制劑12.5μl，室溫靜置5min，然后將轉染試劑與稀釋miR-21抑制劑混合，室溫下靜置20min后，分別鋪到6孔板中，在37℃、5%CO2的培養箱培養，供后續實驗使用。

1.2.4 Western blot(免疫印跡)檢測PTEN蛋白:首先進行總蛋白的提取。用Bio-Rad凝膠成像顯色儀行發光檢測，Quantity One軟件顯色凝膠圖像的光吸光度。以β-actin蛋白為內參照，以PTEN條帶與β-actin條帶吸光度值的比值表示。

1.2.5 流式細胞術測定各組細胞凋亡率:首先消化細胞，再用培養基洗脫細胞，1 000r/min離心10min收集細胞，PBS洗滌2次，75%乙醇(冰預冷)固定，流式細胞儀測定細胞的凋亡率。

1.2.6 療效評估標準:按照WHO制定的實體瘤客觀療效評定標準分為完全緩解(Complete response,CR)、部分緩解(Partial response,PR)、疾病穩定(Stable disease,SD)、疾病進展(Progressive disease,PD)。總有效率RR為(CR+PR)%。CR或PR者4周后復查CT進行療效確認。

2 結果

2.1 結腸癌組織中miR-21和PTEN的表達情況 miR-21在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見表1。PTEN表達于細胞核或漿中，呈棕黃色。PTEN在結腸癌組織中陽性率顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表1，而且miR-21與PTEN的表達之間呈負相關(P<0.05)；另外miR-21在40例結腸癌患者的表達與腫瘤的分化程度有關(P<0.05)。

表1 miR-2和PTEN在結腸癌組織中的表達情況

注:癌旁正常組織與結腸癌組織比較,*P<0.05。

2.2 結腸癌組織中miR-21和PTEN表達與化療藥物療效的相關性 結腸癌組織化療前miR-21的表達在(CR+PR)組的表達量低于(PD+SD)組，而PTEN在(CR+PR)組的陽性率高于(PD+SD)組，P<0.001。見表2。

表2 化療前組織中miR-21和PTEN表達與化療藥物療效的相關性分析

注：兩組相比，*P<0.05。

2.3 qRT-PCR檢測各組細胞miR-21的表達 結腸癌細胞株SW480組(對照組)、轉染miR-21抑制劑抑制組以及耐藥細胞組，發現耐藥細胞組miR-21表達高于對照組(P<0.001)，明顯高于轉染抑制組(P<0.001)，而對照組miR-21表達高于轉染抑制組(P<0.001)。見表3。

表3 qRT-PCR檢測各組細胞miR-21的表達

注：與對照組相比，*P<0.001;與對照組和抑制組相比，#P<0.001。

2.4 Western blot檢測各組PTEN的表達 PTEN 蛋白在轉染抑制組表達量為1.65±0.07，顯著高于對照組的1.00±0.05(P<0.001),耐藥細胞組中的表達量為0.60±0.10,顯著低于對照組和轉染抑制組(P<0.001)。見圖1。

圖1 Western blot檢測各組PTEN的表達

2.5 流式細胞儀測定各組細胞的凋亡率 耐藥組細胞凋亡率明顯低于轉染抑制組(P<0.001)，也低于對照組(P<0.001)，而對照組細胞凋亡率明顯低于轉染抑制組(P<0.001)。見表4。

表4 流式細胞術測定各組細胞凋亡率的比較結果

注：與對照組相比，*P<0.001;與對照組和抑制組相比，#P<0.001。

3 討論

結腸癌是我國十大惡性腫瘤之一，其常見的治療手段之一就是化療，但很多結腸癌尤其是中晚期結腸癌患者的化療效果不佳，主要原因是對化療藥物不敏感，因此提高化療藥物敏感性是當前醫療工作者急需解決的問題。

miR-21作為microRNA的一個重要分子，在多種腫瘤中表達均增高，并與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡有密切關系。而同時發現miR-21與腫瘤的耐藥也有密切關系，在多種耐藥的腫瘤細胞中miR-21的表達增高。PTEN是重要的抑癌基因之一，它能夠抑制腫瘤細胞的增殖、浸潤、侵襲及轉移，同時其也是miR-21重要的靶基因之一。抑制腫瘤細胞中miR-21的表達，PTEN表達會相應上調。研究發現，在多種腫瘤細胞中，miR-21通過下調PTEN表達水平增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥[5-9]。

本研究從臨床和細胞學兩個方面進行研究：發現miR-21和PTEN的表達在結腸癌組織和癌旁組織中有差異，而且在結腸癌組織中miR-21與PTEN的表達之間呈負相關；結腸癌晚期患者進行化療后療效評估，發現化療前組織miR-21的表達和PTEN的表達在(CR+PR)組的表達量不同于(PD+SD)組；細胞實驗中對照組、轉染抑制組以及耐藥細胞組，各組細胞miR-21、PTEN的表達、細胞凋亡率都存在差異，當抑制miR-21表達時PTEN表達增高，并且耐藥細胞組中miR-21表達明顯高于對照組，PTEN表達則明顯低于對照組，凋亡率也是耐藥組最低。這些實驗結果再次證實PTEN為miR-21的靶基因，另外也表明miR-21可能通過作用于PTEN來調節細胞凋亡從而參與結腸癌細胞的耐藥，提示結腸癌中miR-21和PTEN聯合檢測可成為有效的輔助預測化療療效的敏感指標，為耐藥的腫瘤患者帶來福音，可能為腫瘤的治療提供新的途徑。