體色差異豹紋鰓棘鱸的色素及酶含量分析

鄧 成,陳帥龍,葉恒振,齊興柱,駱 劍

(海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室海南省水產種業工程研究中心海南省熱帶水生生物技術重點實驗室,中國海南 海口 570228)

豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus),俗稱東星斑,屬于鱸形目、鱸亞目、鮨科、鰓棘鱸屬,為暖水性礁棲魚類,廣泛分布于太平洋西岸、印度洋等海域。豹紋鰓棘鱸的體色會隨環境改變,體色鮮艷、變化豐富,是研究魚類體色發育與變異的好材料。豹紋鰓棘鱸常規體色呈紅色或鮮橘紅色,全身布滿藍色或藍白色的圓形或橢圓形斑點,而養殖個體常常呈現黑棕色。體色鮮紅的豹紋鰓棘鱸很受市場歡迎,具有較高的經濟價值。

目前,國內外學者在魚類體色相關的機制方面已有初步研究[1～4]。魚類的體色是由真皮層色素細胞的色素顆粒運動以及光反射器官的光散射產生的物理顏色,色素顆粒在細胞內延伸和擴散,從而改變體表的顏色。色素細胞及色素顆粒的分布、大小、種類、密度、排列方式的不同,很大程度上直接影響了魚類體色的呈現結果[5]。依據包含的色素顆粒、色素、形態和運動型,色素細胞分為以下 6 種：黑色素細胞(melanophore)、白色素細胞(leucophore)、紅色素細胞(erythrophore)、黃色素細胞(xanthophore)、藍色素細胞(cyanophore)和虹彩色素細胞(iridophore)。黑色素細胞內含黑色素顆粒,分泌黑色素,使體表呈現黑色或者褐色。Fujii[6]的研究表明,體色深淺變化與黑色素顆粒聚集程度有關,顆粒距離越遠,體色越淺。白色素細胞包含白色顆粒,分泌尿酸和鳥嘌呤,因反光使體表呈現白色。紅色素細胞和黃色素細胞包含胡蘿卜素和類胡蘿卜素,色素細胞形成與脂肪代謝相關,呈現紅色、橙色或者黃色。程煒軒等[7]在黃顙魚中發現,黑色素缺失會使魚體出現黃化現象。藍色素細胞呈圓形;虹彩色素細胞呈棒狀或顆粒狀,包含反射小板,富含鳥嘌呤,細胞可排列形成光反射層。劉曉東等[8]在七彩神仙魚中發現其表皮藍條紋區有大量虹彩色素細胞和黑色素細胞。黑色素代謝酶(melanin metabolic enzyme,MME)是黑色素代謝的一種關鍵活性金屬蛋白酶,該酶可將黑色素轉化為氨基酸,從而清除機體表皮的黑色素。

魚類在適應環境的過程中,會產生生理上的體色變化。其中,色素細胞可通過運動改變自身體色[9],同時也可通過色素細胞的增殖或者減少對體色產生影響。此外,光感受也會導致體色變化,例如光照周期、光照強度等會影響內分泌系統對酶活及色素細胞生成代謝的調控[10]。

本文首先對體色具有顯著差異的豹紋鰓棘鱸個體的表觀體色特征進行分類分析,然后檢測體色差異樣本的主要色素含量,同時判斷體色差異是否與色素代謝酶的含量存在聯系,以揭示豹紋鰓棘鱸體色變異的形態學和色素生理學規律,為探討礁棲石斑魚體色變異機制提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用豹紋鰓棘鱸采集于海南省瓊海市鴻茂水產有限公司基地,從養殖群體中篩選體色差異較大的紅色和黑色個體各30 尾,每尾體長為 35±5 cm,體重為 520±20 g。

1.2 實驗分組

實驗分為8 組：1)紅色個體背部組(RB); 2) 黑色個體背部組(BB); 3) 紅色個體腹部組(RF); 4) 黑色個體腹部組(BF);5) 紅色個體尾部組(RW); 6) 黑色個體尾部組(BW);7)紅色個體血液組(RX); 8) 黑色個體血液組(BX)。

1.3 體色觀察

將采集到的樣本放置于攝影燈箱內,使用索尼數碼相機(DSC-WX500)拍照保存。采用Motic SMZ-168 體視系統記錄皮膚色斑分布。

1.4 色素提取和酶含量分析

在實驗樣本中挑選出典型的紅色或黑色個體各4 尾,采用手術刀及鑷子將全部實驗用魚的背部、腹部、尾部皮膚組織(1 cm × 1 cm)取下,并快速放置于-80 ℃的冰箱內冷凍保存備用。采用10 mL注射器抽取樣本血液于1.5 mL 離心管中,靜置過夜后提取血漿保存于4 ℃冰箱備用。

對于豹紋鰓棘鱸組織樣品的色素提取和黑色素酶含量的檢測,本文主要參考魚黑色素(Fish)酶聯免疫分析試劑盒、魚黑色素代謝酶(MME)酶聯免疫分析試劑盒、魚胡蘿卜素(carotene)酶聯免疫分析試劑盒、魚類胡蘿卜素(carotenoids)酶聯免疫分析試劑盒中的操作步驟進行。所用試劑盒均購置于上海江萊生物科技有限公司。

1.5 統計分析

使用SPSS 18.0 分析軟件對實驗數據(平均值±標準差,±s)進行單因素方差分析,利用Duncan法進行多重比較,顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 豹紋鰓棘鱸的表觀體色差異

本文選取了體色為紅、黑的典型差異個體,在兩種體色的豹紋鰓棘鱸表皮中均觀察到黑色素細胞、紅色素細胞。其中,黑色個體體表分布大量黑色素細胞(圖1F～H),紅色個體體表主要分布紅色素細胞(圖1C～E)。此外,我們在豹紋鰓棘鱸表皮觀察中發現其背部和尾部的顏色較深,而腹部的顏色較淺(圖 1A,1B)。

2.2 豹紋鰓棘鱸不同組織的黑色素含量

根據試劑盒操作說明對豹紋鰓棘鱸紅、黑個體進行不同部位皮膚和血漿黑色素含量的測定,結果如圖 2 所示。BB 組、BF 組、BW 組和 BX 組的黑色素含量分別為 10.46 μg/g、7.55 μg/g、9.83 μg/g、11.25 μg/g; RB 組、RF 組、RW 組和 RX 組的黑色素含量分別為 6.91 μg/g、4.56 μg/g、5.97 μg/g、7.17 μg/g。

對檢測結果進行統計分析發現,黑色個體中,背部和尾部皮膚的黑色素含量無顯著性差異(P＞0.05),但均顯著高于腹部皮膚中的黑色素含量(P＜0.05);紅色個體中,背部黑色素含量顯著高于腹部皮膚中的黑色素含量(P＜0.05),而背部和尾部中的黑色素含量無顯著性差異(P＞0.05)。此外,黑色個體在背部、腹部中的黑色素含量均顯著高于紅色個體;黑色個體血漿中的黑色素含量與紅色個體血漿中的黑色素含量存在顯著性差異。

2.3 豹紋鰓棘鱸不同組織中黑色素酶的含量

豹紋鰓棘鱸紅、黑個體皮膚和血漿中黑色素酶的含量測定結果如圖 3 所示。BB 組、BF 組、BW組、BX 組的黑色素酶含量分別為0.21 ng/g、0.19 ng/g、0.22 ng/g、0.13 ng/g;RB 組、RF 組、RW 組、RX 組的黑色素酶含量分別為0.32 ng/g、0.39 ng/g、0.30 ng/g、0.47 ng/g。在黑色個體,背部、腹部和尾部皮膚中的黑色素酶含量無顯著性差異。就腹部皮膚而言,黑色素酶在紅色個體中的含量顯著高于黑色個體,但紅色個體在背部和尾部皮膚中的黑色素酶含量無顯著性差異。此外,黑色素酶含量在黑色個體血漿與紅色個體血漿間存在顯著性差異。

2.4 豹紋鰓棘鱸不同組織中類胡蘿卜素的含量

BB 組、BF 組、BW 組和 BX 組的類胡蘿卜素含量分別為 92.15 mg/g、62.64 mg/g、90.55 mg/g、173.64 mg/g; RB 組、RF 組、RW 組和 RX 組的類胡蘿卜素含量分別為 140.66 mg/g、88.76 mg/g、147.73 mg/g、208.15 mg/g。紅色個體中,背部和尾部皮膚的類胡蘿卜素含量無顯著性差異,但均顯著高于腹部皮膚中的類胡蘿卜素含量; 黑色個體中,背部和尾部皮膚的類胡蘿卜素含量無顯著性差異,但也均顯著高于腹部皮膚中的類胡蘿卜素含量。紅色個體在不同組織中的類胡蘿卜素含量均顯著高于黑色個體(圖4)。

圖1 豹紋鰓棘鱸體色變異與表皮顯微觀察結果(A) 紅色個體; (B) 黑色個體; (C) 紅色個體背部表皮; (D) 紅色個體腹部表皮; (E) 紅色個體尾部表皮; (F) 黑色個體背部表皮; (G) 黑色個體腹部表皮; (H) 黑色個體尾部表皮。Fig.1 Microscopic observation of body color variation and epidermis of P.leopardus(A) The red individual; (B) The black individual; (C) Back epidermis of the red; (D) Abdominal epidermis of the red; (E) Tail epidermis of the red; (F) Back epidermis of the black; (G) Abdominal epidermis of the black; (H) Tail epidermis of the black.

圖2 豹紋鰓棘鱸紅、黑個體皮膚和血液中黑色素含量的比較圖中a～e 不同字母表示組間存在顯著性差異。BB：黑色個體背部皮膚;RB：紅色個體背部皮膚; BF：黑色個體腹部皮膚;RF：紅色個體腹部皮膚;BW：黑色個體尾部皮膚; RW：紅色個體尾部皮膚;BX：黑色個體血液;RX：紅色個體血液。Fig.2 Comparison of skin and blood melanin contents in red and black individuals of P.leopardusDifferent letters a ～e mean significant differences between groups.BB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds; BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

圖3 豹紋鰓棘鱸紅、黑個體皮膚和血液中黑色素酶含量的比較BB：黑色個體背部皮膚; RB：紅色個體背部皮膚; BF：黑色個體腹部皮膚; RF：紅色個體腹部皮膚; BW：黑色個體尾部皮膚; RW：紅色個體尾部皮膚; BX：黑色個體血液; RX：紅色個體血液。Fig.3 Comparison of skin and blood melaninase con原tents in red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

圖4 豹紋鰓棘鱸紅、黑個體不同組織類胡蘿卜素含量的比較BB：黑色個體背部皮膚; RB：紅色個體背部皮膚; BF：黑色個體腹部皮膚; RF：紅色個體腹部皮膚; BW：黑色個體尾部皮膚; RW：紅色個體尾部皮膚; BX：黑色個體血液; RX：紅色個體血液。Fig.4 Comparison of the carotenoid content in different tissues of red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

2.5 豹紋鰓棘鱸不同組織中胡蘿卜素的含量

豹紋鰓棘鱸紅、黑個體均進行了皮膚和血漿胡蘿卜素的含量測定,結果如圖5 所示。BB 組、BF 組、BW 組、BX 組的胡蘿卜素含量分別為50.94 mg/g、33.09 mg/g、54.11 mg/g、103.30 mg/g;RB 組、RF 組、RW 組、RX 組的胡蘿卜素含量分別為 80.91 mg/g、45.84 mg/g、85.62 mg/g、111.04 mg/g。

紅色個體中,背部和尾部皮膚的胡蘿卜素含量無顯著性差異,但均顯著高于腹部皮膚中的胡蘿卜素含量; 黑色個體中,背部和尾部皮膚的胡蘿卜素含量無顯著性差異,但也均顯著高于腹部皮膚中的胡蘿卜素含量。紅色個體在不同組織中的胡蘿卜素含量均顯著高于黑色個體。

3 討論

3.1 皮膚和血液中胡蘿卜素和類胡蘿卜素含量與體色的關系

魚類體色組成的基本色素包括黑色素、類胡蘿卜素群、紅色素、黃色素等。由于魚體不能自身合成胡蘿卜素和類胡蘿卜素,需要通過攝食來獲取,因此其著色程度受類胡蘿卜素攝入量的影響。朱藝峰等[11]報道通過飼料中添加類胡蘿卜素,可增加養殖魚類的肌肉著色度。在花瑪麗魚的研究中,飼料中類胡蘿卜素含量的差異,可導致個體呈現出不同的體色,其中在飼料中添加400 mg/kg類胡蘿卜素對其體色的影響最為明顯[12]。周邦維等[13]在有關豹紋鰓棘鱸生長發育所需營養物質的研究中發現,胡蘿卜素的含量在很大程度上影響了豹紋鰓棘鱸皮膚中色素的含量。

圖5 豹紋鰓棘鱸紅、黑個體皮膚及血液中胡蘿卜素含量的比較BB：黑色個體背部皮膚; RB：紅色個體背部皮膚; BF：黑色個體腹部皮膚; RF：紅色個體腹部皮膚; BW：黑色個體尾部皮膚; RW：紅色個體尾部皮膚; BX：黑色個體血液; RX：紅色個體血液。Fig.5 Comparison of the carotene content in different body parts of red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

黃色、橙色和紅色錦鯉所含的主要色素組分可能分別是α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和蝦青素[14]。有研究表明,不同種群的紅身藍首魚的著色變化取決于類胡蘿卜素的含量與種類。在金色和灰色變種個體的皮膚中,類胡蘿卜素含量具有顯著性差異; 而在灰色向金色轉變的樣本中,與黑色素細胞的凋亡和類胡蘿卜素的積累相關的基因呈現出顯著的表達差異[15～17]。

本研究觀察結果表明,豹紋鰓棘鱸各個部位皮膚的呈色存在差異,在紅色和黑色個體中,背部和尾部的顏色均較深而腹部較淺,背部與尾部是紅色素細胞與黑色素細胞分布集中的區域,而這些細胞在腹部的分布則比較稀疏。各部位色素含量的檢測結果也顯示,豹紋鰓棘鱸背部和尾部的色素含量較高,其中紅色個體各部位的胡蘿卜素與類胡蘿卜素含量均顯著高于黑色個體相應的部位; 腹部色素含量較低,紅、黑個體腹部皮膚的胡蘿卜素和類胡蘿卜素含量在所有部位中最低,這與表觀體色規律保持一致,說明胡蘿卜素與類胡蘿卜素對豹紋鰓棘鱸體色影響顯著,兩種色素含量越高,體色越鮮艷。盡管黑色個體的胡蘿卜素與類胡蘿卜素含量較紅色個體而言整體偏低,但是在血漿中仍然有較高的含量,這說明皮膚對色素的吸收或代謝的差異,也是導致豹紋鰓棘鱸體色差異的重要原因。

3.2 黑色素、黑色素酶與豹紋鰓棘鱸體色的關系

黑色素細胞是皮膚中的一種特殊細胞,能夠產生黑色素并且傳遞給周圍的角質細胞,從而使皮膚呈現黑色和褐色。大菱鲆的白化與黑色素的含量有關,研究顯示體色正常的個體與體色白化的個體在黑色素含量上有著顯著的差異[18]。孔雀魚中黑色素的形成由一對等位基因控制,顯性基因個體的黑色素細胞可分泌豐富的黑色素,而隱性基因個體的黑色素細胞分泌黑色素較少[19]。在紅鯽魚中,黑色素細胞出現在胚胎和幼魚的階段,隨著黑色素細胞的消失,紅色鯽魚的體色在形成過程中由深灰色變為紅橙色[20]。本研究結果顯示,在豹紋鰓棘鱸個體中,各個部位的黑色素含量均表現為黑色個體顯著高于紅色個體,這也與顯微鏡的觀察結果相吻合。此外,豹紋鰓棘鱸腹部較淺,這也與其黑色素含量較低相關。

同時,本研究的檢測數據顯示,豹紋鰓棘鱸紅、黑個體之間的色素差異也表現在血漿色素含量上,黑色個體與紅色個體血漿中的黑色素含量分別為 11.25 μg/g 和 7.17 μg/g,存在顯著性差異,這種差異可能與黑色素合成相關。酪氨酸蛋白酶的活性被廣泛證明與黑色素生成呈正相關。相關研究報道,刺鼠信號蛋白會抑制酪氨酸蛋白酶的活性,進而減少黑色素的產量[21]; 熊果素和Vc 能抑制斑馬魚中酪氨酸酶的活性,進而抑制黑色素顆粒的生成量[22]。此外,飼料添加物、外部環境等也會影響黑色素的合成[13,23～24]。豹紋鰓棘鱸在野生環境下多呈紅色,而網箱養殖群體多顯色較深,這可能與其外部環境及餌料的改變相關。

黑色素酶主要在氨基酸氧化酶的作用下經脫氨基反應清除機體表皮沉淀的黑色素。本文的結果顯示,豹紋鰓棘鱸紅色個體中的黑色素代謝酶含量顯著高于黑色個體,高水平的黑色素酶含量可能伴隨較高的黑色素分解,從而導致紅色色素更容易顯現出來。魚類通過內分泌調節色素細胞器的轉運機制,通過酶代謝及激素作用的方式介導體色機制的改變[1]。豹紋鰓棘鱸紅色個體血液中的黑色素酶含量為0.47 ng/g,而黑色個體血液中的含量僅為0.13 ng/g,二者間不僅存在顯著性差異,且與黑色素含量呈現負相關。豹紋鰓棘鱸皮膚的黑色素含量顯著影響了其呈色,而黑色素的含量不僅與黑色素的合成量相關,也與黑色素酶的活性相關,后者決定了黑色素的清除效率。

綜上所述,豹紋鰓棘鱸皮膚黑色的呈現與黑色素和黑色素酶的含量相關; 而紅色的呈現與胡蘿卜素、類胡蘿卜素等的含量相關; 其不同部位的皮膚的色素沉積和代謝存在顯著差異。豹紋鰓棘鱸紅、黑體色的差異可能主要通過色素細胞分布、色素的沉積機制、黑色素代謝機制共同調控。