胰腺癌中CDK1的表達與預后的生物信息學分析

楊萬霞,潘云燕,李 雪,管沛文,尤崇革

(蘭州大學第二醫院檢驗醫學中心,中國甘肅 蘭州 730030)

近年來,全世界胰腺癌發病率明顯上升[1],其預后極差,死亡率極高,癥狀出現后平均壽命僅為1年左右。美國疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)的最新數據顯示：胰腺癌的5年生存率僅為8%,在美國已躍居所有腫瘤致死率第4 位[2],在我國也已高居第6 位[3]。胰腺癌起病隱匿,80%的胰腺癌患者在確診時已經發現有轉移[4],這嚴重威脅著人們的身心健康。因此,從分子水平探究胰腺癌的早期標志物,做到早期診斷就顯得尤為重要。相關研究表明,DNA 修復基因異常在胰腺癌中起著重要作用,90%的胰腺癌可能存在K-ras 基因第12 號密碼子的點突變[5～6]; K-ras、p53、SMAD4 基因突變與胰腺癌的不良預后有關[7～8]。周期蛋白依賴性激酶1 (cyclin-dependent kinase 1,CDK1)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,在細胞周期中與基因修復密切相關[9],其異常表達與多種腫瘤的發生相關[10～12],但CDK1 與胰腺癌的發生及預后關系尚不清楚。

基因表達譜(gene expression omnibus,GEO)數據庫為癌癥相關基因表達譜的生物信息學挖掘提供了可能[13]。本研究首先通過生物信息學方法篩選出胰腺癌芯片數據GSE16515 中的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),并對其進行GO 分析和KEGG 通路富集分析,然后通過構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡,篩選出hub 基因并驗證,旨在為胰腺癌分子機制的進一步研究提供生物信息學依據。

1 材料和方法

1.1 芯片數據來源

本研究從 GEO (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫下載基因芯片數據集GSE16515,芯片總共包含52 例樣本,其中36 例為胰腺癌患者腫瘤組織樣本(男性22 人,女性14 人,年齡為49～84);16 例為胰腺癌患者正常組織樣本(男性12 人,女性 4 人,年齡為 51～84)。芯片平臺是 GPL570[HGU133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array,表達數據為expression profiling by array,種屬為Homo sapiens。

1.2 數據處理

用 GEO2R (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)[14]在線工具分析胰腺癌樣本與正常樣本的基因數據。將胰腺癌組織芯片GSE16515 矩陣數據的探針名轉化為基因名,對原始數據進行去重等處理后,以|log2FC|＞2 且 P＜0.01 的標準篩選出DEGs,用R 語言繪制熱圖。

1.3 DEGs的富集分析

為了解DEGs 的功能,我們用DAVID(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)[15]在線分析數據庫對DEGs 進行GO 分析和KEGG 通路分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.4 PPI網絡構建和關鍵基因篩選

通過在線分析網站STRING (Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes,https：//string-db.org/)[16]得到DEGs 的蛋白質互作網絡,以TSV 格式導出。將所得源文件導入Cytoscape 進行可視化分析,并用插件cytoHubba 進行hub 基因分析,同時采用MCC 算法,選取排名靠前的10 個hub 基因。

1.5 PPI功能模塊分析

為進一步明確胰腺癌可能的信號通路,我們在進行PPI 網絡構建后,用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件對PPI 網絡進行聚類分析,得到PPI功能模塊,然后用DAVID 數據庫將功能模塊中的基因進行KEGG 通路分析。

1.6 關鍵基因驗證分析

為驗證hub 基因的功能,我們利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,http：//gepia.cancer-pku.cn/)[17]數據庫分析 hub 基因在胰腺癌組織和正常組織中的表達水平,并繪制hub 基因的Kaplan-Meier 生存曲線。

1.7 靶基因在胰腺癌組織及細胞系中的表達分析

為評價hub 基因在胰腺癌組織及細胞系中的表達水平,我們利用CCLE (Cancer Cell Line Encyclopedia,https：//portals.broadinstitute.org/ccle/)[18]數據庫分析了hub 基因在轉錄組水平的表達情況。下載數據為mRNA expression (Affy),得到hub基因在不同腫瘤中的表達情況,然后篩選出胰腺癌細胞數據,并根據其表達值繪圖,以分析hub基因在胰腺癌不同細胞類型中的表達水平。

2 結果

2.1 胰腺癌患者中腫瘤組織和正常組織的DEGs

通過對基因芯片GSE16515 進行數據分析,總共獲得376 個DEGs(胰腺癌組/正常對照組),其中上調基因和下調基因分別為301 個和75 個。差異基因在兩組中的表達情況如圖1 所示。

2.2 GO和KEGG通路富集分析

圖1 差異基因熱圖分析Fig.1 Heatmap analysis of differential genes

GO 可分為生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。采用 DAVID 對 376 個 DEGs進行GO 和KEGG 通路富集分析。DEGs 生物過程主要涉及信號轉導、凋亡過程、細胞增殖、蛋白質水解作用、氧化還原過程、細胞外基質分解、細胞黏附、膠原蛋白分解代謝等。細胞學組成分析顯示這些基因大多參與細胞表面、膜錨定、質膜組成、頂端等離子體膜、內質網腔、高爾基腔、膠原蛋白三聚物、細胞外基質、細胞外區、細胞外泌體等的組成。分子功能的變化主要集中在離子結合、氧化還原酶活性、金屬內肽酶活性、結構分子活性、膠原蛋白結合、肌動蛋白結合等。KEGG 通路富集分析表明,差異基因主要涉及細胞外基質受體交互通路、蛋白質消化和吸收、PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、癌癥途徑、腫瘤的轉錄調控失調、視黃醇代謝、甘油三酯代謝等(圖2)。

2.3 差異表達基因的PPI網絡分析

將376 個顯著差異基因輸入STRING 數據庫,然后將所得數據導入Cytoscape 中,利用插件cytoHubba 找出排名靠前的10 個hub 基因,分別為 CDK1、CCNB1、CDC20、TOP2A、PTTG1、BUB1、RRM2、CENPF、DLGAP5、ASPM (圖 3A)。其中,節點度最高的CDK1 的PPI 網絡圖如圖3B 所示。

2.4 PPI功能模塊分析

用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件對PPI網絡進行聚類分析,得到MCODE 得分排名靠前的兩個PPI 功能模塊(圖4)。通過DAVID 在線分析工具對模塊中包含的基因進行KEGG 通路分析,發現其主要涉及細胞周期、p53 信號通路、蛋白質消化吸收、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt 信號通路、血小板激活信號通路(表1,表2)。

2.5 關鍵基因驗證

用GEPIA 數據庫驗證10 個hub 基因在胰腺癌組織(179 例)和正常組織(171 例)中的表達差異,發現10 個hub 基因均在胰腺癌組織中高表達,差異有統計學意義(P＜0.05),其中hub 基因中節點度最高的CDK1 的表達水平如圖5A 所示。進一步用GEPIA 數據庫繪制胰腺癌中hub 基因高表達組和低表達組的Kaplan-Meier 生存曲線,結果顯示除了CDC20 和CENPF 高、低表達組的生存期無明顯差異外,其余8 個hub 基因高表達的胰腺癌患者的生存期明顯低于低表達患者,差異有統計學意義(P＜0.05)。CDK1 與胰腺癌患者生存期的關系如圖5B 所示。

2.6 CDK1在胰腺癌組織及細胞系中的表達水平

為進一步探究CDK1 在胰腺癌中的表達水平,我們通過CCLE 數據庫檢索了CDK1 在40 種不同類型惡性腫瘤中的表達情況,結果顯示胰腺癌中CDK1 有較高的表達水平(圖6A),而且CDK1在胰腺癌不同細胞株中均有較高的表達(圖6B)。

3 討論

胰腺癌早期診斷困難,死亡率較高,從分子生物學水平研究其早期標志物能有效提高胰腺癌的檢出率。基因芯片技術和生物信息學分析技術已廣泛用于基因的篩查,本研究采用生物信息學方法對GEO 數據庫中的胰腺癌基因芯片數據集GSE16515 進行了分析。

圖2 胰腺癌中差異表達基因的GO 分析和KEGG 通路富集分析Fig.2 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway of DEGs in pancreatic cancer

表1 功能模塊A 內基因的KEGG 通路分析Table 1 KEGG pathway analysis of genes in functional module A

表2 功能模塊B 內基因的KEGG 通路分析Table 2 KEGG pathway analysis of genes in functional module B

圖3 差異基因所編碼蛋白質的PPI 分析圖和關鍵基因篩選結果(A) DEGs 的 PPI 網絡圖; (B) CDK1 的 PPI 網絡放大圖。Fig.3 PPI analysis of proteins encoded by DEGs and screening of key genes(A) PPI network diagram of DEGs; (B) PPI network amplification diagram of CDK1.

圖4 功能模塊圖(A) MCODE 得分 17; (B) MCODE 得分 9.176。Fig.4 Functional module diagram(A) MCODE score 17; (B) MCODE score 9.176.

圖5 胰腺癌中CDK1 的驗證結果(A) 胰腺癌中CDK1 的表達(紅色表示179 例胰腺癌組織,灰色表示171 例正常組織,*：P＜0.05); (B) CDK1 的表達與胰腺癌預后的關系(紅線表示高表達組,藍線表示低表達組)。Fig.5 Validation of CDK1 in pancreatic cancer(A) Expression of CDK1 in pancreatic cancer (red represents 179 pancreatic cancer tissues,and gray represents 171 normal tissues,*：P＜0.05); (B)Relationship between CDK1 expression and pancreatic cancer prognosis(the red line represents the high expression group,and the blue line represents the low expression group).

文中共篩選出376 個DEGs,其中上調基因和下調基因分別為301 個和75 個。為進一步了解這些差異基因的功能,我們進行了GO 分析,結果顯示胰腺癌相關基因大多富集于胞外區,參與生物體膜的組成,與細胞增殖、凋亡等過程有關,介導的分子功能有離子結合、氧化還原酶活性、金屬內肽酶活性、膠原蛋白結合、肌動蛋白結合等。而細胞周期的異常與腫瘤的發生發展密切相關[19],故推測DEGs 可通過細胞周期等過程參與胰腺癌的發生發展。之前的研究指出,細胞周期進程是錨定依賴性的[20],需要細胞外基質受體交互通路整合跨膜受體并形成肌動蛋白相關黏附復合物[21～22]。一項胰腺癌系統分析的研究指出,細胞外基質受體交互通路在胰腺癌的進展中起著重要作用[23]。相關研究報道,作為核轉錄因子的p53 蛋白可通過激活多種靶基因的表達,誘導細胞DNA 損傷,促進腫瘤細胞凋亡[24～25];PI3K-Akt 通路在腫瘤中起著非常重要的作用[26]。此外,研究表明PI3K/Akt/mTOR 信號通路也參與胰腺癌的進程[27]。與上述報道一致,本文的KEGG 通路富集分析結果表明,差異基因主要涉及細胞外基質受體交互通路、PI3K-Akt 通路、p53 通路等,由此得出,胰腺癌的發生與細胞外基質受體交互通路、PI3K-Akt 通路、p53 通路等密切相關。

圖6 CCLE 數據庫中CDK1 在不同惡性腫瘤及胰腺癌細胞系中的表達(A) CDK1 在不同惡性腫瘤中的表達; (B) CDK1 在胰腺癌細胞系中的表達。Fig.6 Expression levels of CDK1 in different malignant tumors and pancreatic cancer cell lines in CCLE database(A) Expression of CDK1 in human malignant tumors; (B) Expression of CDK1 in different cell lines of pancreatic cancer.

此外,文中篩選的10 個hub 基因CDK1、CCNB1、CDC20、TOP2A、PTTG1、BUB1、RRM2、CENPF、DLGAP5 和ASPM 均在胰腺癌組織中顯著高表達。其中,CDK1、BUB1 和CDC20 在胰腺癌的研究中已有報道[28～29],但是關于這些分子的具體作用機制仍不清楚; 而有關CCNB1、TOP2A 在胰腺癌中的作用機制則已有相對深入的研究[30～31]。本文篩選出來的節點度最高的CDK1 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,其高表達與胰腺癌不良預后顯著相關。CDK1 與CCNB1 結合形成的異二聚體是真核細胞有絲分裂G2/M 期轉換所必需的蛋白激酶,而腫瘤的發生與細胞周期的異常有著密不可分的關系。近期研究表明,在許多腫瘤中CDK1表達活躍,其可作為黑色素瘤[32]、膽管癌[33]及結腸癌[34]等的臨床預后標志物。由此推測,CDK1 可能與促進胰腺癌細胞有絲分裂、增殖、侵襲轉移有關。

綜上所述,我們通過生物信息學分析確定了胰腺癌差異表達的基因,并且由蛋白質互作和CCLE 數據庫分析可知,CDK1 在胰腺癌中是一種高表達分子,有望成為胰腺癌早期診斷新的分子標志物和治療靶標。但本研究的芯片數據為單中心研究,代表性較差。因此,后續還需要進行一系列實驗來驗證本文的預測結果。