Nafion/MWCNTs/GC 納米電化學傳感器法快速檢測水產養殖中的孔雀石綠

尚晶晶，郝雅茹，李書國，張薇

（1.河北科技大學生工學院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050018）

孔雀石綠（Malachite Green,MG）是一種合成類的三苯基甲烷類工業染料和抗菌效果很強的低廉藥物染料，廣泛用于預防與治療水產養殖中的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[1]。MG 進入人類或動物機體后通過生物轉化生成脂溶性的隱孔雀石綠（Leucomalachite green,LMG）。MG 類化合物及其LMG 均具有高殘留及高毒性，可產生致癌、致畸、致突變等副作用[2]。世界各國對水產品中MG 及其代謝產物LMG 的殘留均有嚴格明確的限量標準。美國、日本規定在食用水產品中禁止檢出孔雀石綠和無色孔雀石綠。我國于2005 年制定了孔雀石綠的限量標準，要求在水產品中的檢出不得超過1 μg/kg[3]。因此，建立快速、高效地檢測水產品中孔雀石綠及其代謝產物無色孔雀石綠殘留的檢測方法，具有十分重要的社會意義和技術應用前景。

目前，主要用理化方法和免疫方法檢測MG 及LMG 的殘留量。前者應用最廣的是高效液相色譜（HPLC）[4-10]和高效液相色譜—串聯質譜（HPLCMS）[11-17]。該類方法檢測限低、準確度高，但其設備昂貴、對檢測人員技術要求高、耗時長等，不適于現場大批量快速檢測。免疫方法應用最多的是酶聯免疫吸附法[18-23]。此類方法特異性強，樣本容量大但假陽性率比較大，檢測精度低，準確性差。而電化學方法靈敏度高、速度快、樣品前處理簡單等，在食品安全檢測、環境監測、疾病診斷等領域快速發展。電化學傳感器檢測方法,主要通過電流、電位或阻抗等電化學信號直接或間接分析待測物質。在食品安全領域可用于檢測農獸藥殘留、激素殘留、違禁物質添加、添加劑超標以及加工過程中是否產生有毒有害物質等。惠媛媛等[24]詳細闡述了黃曲霉毒素在免疫傳感器、核酸適體傳感器、酶傳感器三種不同類型電化學傳感器的研究進展，認為電化學傳感器對有毒有害物質的監測和檢測具有重要意義。金麗華和李青葉[25]制備納米電化學傳感器用于熱加工食品中丙烯酰胺的快速測定。在環境檢測中，如Wei等[26]詳細研究了利用納米傳感器的交流阻抗變化檢測3,3',4,4'-四氯聯苯的方法；在醫療診斷方面，可用于激素、乳腺癌、類風濕關節炎等的診斷。

本文利用Nafion 和MWCNTs/GC 制備電化學納米傳感器，研究MG 在修飾電極表面的電化學性質，優化試驗條件，建立了Nafion/MWCNTs/GC 納米電化學傳感器快速測定水產養殖中MG 含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗使用的儀器與設備如下：天津蘭力科化學電子高技術有限公司的LK98BⅡ型微機電化學分析系統；上海CHI 儀器公司的三電極系統、電解杯；上海菁海儀器有限公司的FA 2204 型電子分析天平；昆山市超聲儀器有限公司的KQ 2200 型超聲波清洗儀；上海博訊實業有限公司醫療設備廠的GZX-9070MBE 型電熱鼓風干燥箱。

試驗使用的試劑有：孔雀石綠，山東西亞化學股份有限公司；無水氯化鋰、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀（分析純），十二烷基硫酸鈉（SDS）、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀，天津市博迪化工有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（分析純），天津市大茂化學試劑廠；溴代十六烷基吡啶（CPB），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧基化多壁碳納米管（MWCNTs-COOH），北京德科島金科技有限公司；5%Nafion，美國德邦公司；試驗中溶液用水均為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 電極預處理以及修飾電極制備

將玻碳電極（直徑3mm）用Al2O3粉末（粒徑0.05μm）打磨拋光成鏡面，然后再依次在50%硝酸、無水乙醇、去離子水中分別清洗3min，然后用氮氣吹干待用。

0.1g MWCNTs-COOH 加入到10mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中超聲處理5min 制得均勻分散的MWCNTs-COOH 懸濁液即為MWCNTs-COOH 修飾液。100 μL 5%Nafion 加入到50mL 乙醇得到0.01%Nafion 乙醇溶液即為Nafion 修飾液。10mg/mL MWCNTs-COOH 懸濁液和0.01%Nafion 各取5mL超聲20min 制得混合修飾液，分別取上述三種不同修飾液5μL 于干凈的玻碳電極表面，在紅外燈下烤干制得MWCNTs-COOH/GCE 修飾電極、Nafion/GCE修飾電極以及Nafion MWCNTs-COOH/GCE 修飾電極，于4℃左右貯存備用。

1.2.2 溶液的制備

標準溶液的制備：準確稱量92.70mg MG，先用50mL 去離子水溶解，再用去離子水定容至1000mL，得到1.0×10-4mol/L MG 標準溶液。然后將此標準液依次稀釋為9×10-6mol/L、7×10-6mol/L、5×10-6mol/L、3×10-6mol/L、1×10-6mol/L 和0.3×10-6mol/L 梯度的溶液，于4℃左右儲存備用。

電解質溶液的制備：準確稱量1.271g LiCl 溶于50mL 燒杯，用100mL 容量瓶定容，制得0.3 mol/L LiCl 電解質溶液，將此液依次稀釋為0.25mol/L、0.2mol/L、0.15 mol/L、0.1mol/L、0.05mol/L LiCl 于常溫下儲存備用。

表面活性劑的制備：準確稱量1.92mg CPB、1.44mg SDS 和1.82mg CTAB，用濃度為1.0×10-4mol/L MG 標準溶液先溶解、再定容到100mL 配制濃度5.0×10-5mol/L CPB、SDS 和CTAB 的三種不同表面活性劑；準確稱量3.46mg CPB 配制9.0×10-5mol/L CPB，依次稀釋到9.0×10-5mol/L、7.0×10-5mol/L 和3.0×10-5mol/L，制得不同濃度的CPB溶液于常溫下儲存備用。

1.2.3 Nafion/MWCNTs/GC 納米電化學傳感器法測定MG

電化學分析方法測定均采用三電極系統，即玻碳電極或修飾電極為工作電極、Ag/AgCl 為參比電極、鉑絲為輔助電極。將玻碳電極/修飾電極浸泡在MG 的標準溶液中10 min 富集MG，將富集的MG在0.2mol/L LiCl 為電解質中采用快速循環伏安法（掃描電位為0.3～1V，掃描速度為50mV/s），測定三個平行樣品的MG 氧化峰電流值，其平均值作為MG 的氧化峰電流。

1.3 水樣的采集與處理

取本地某水產養殖場的養殖用水為檢測樣品，靜置30min，再經過0.2μm 濾膜過濾處理后待測。

1.4 數據統計分析

以上測定均為三組平行實驗數據的平均值。運用spss18.0 進行統計分析，以單因素方差分析（oneway analysis of variance）進行顯著性差異分析（P＜0.05），運用OriginLab Origin Pro v8.0 繪制相關的數據圖。

2 結果與分析

2.1 MG 在不同修飾電極上的電化學行為

采用循環伏安法，研究MG 在GC、Nafion/GC、MWCNTs/GC、Nafion/MWCNTs/GC 不同電極上的循環伏安圖。由圖1 可知：在空白電解質無峰，而加入MG 后在0.57V 左右出現氧化峰，但沒有出現還原峰，因為MG 含有兩個氨基，其氧化還原過程中有氫離子得失，所以加入MG 后有峰電流出現，只出現氧化峰說明該反應不可逆；圖1 中（2）與（3）比較，修飾了Nafion/GCE 后其氧化峰電流下降大約40%且電位稍向右移動，這是由于Nafion 在玻碳電極表面形成了一層膜，阻礙了MG 向電極表面的傳質導致電子傳出速率減小和出峰位置向右移動；圖1 中（4）與（3）比較，修飾了MWCNTs-COOH/GCE，峰電流增加大約80%且電位稍向左移動，這是由于MWCNTs-COOH 具有相當大的比表面積，增加了其導電性使電子傳輸速率增大和出峰位置向左移動；圖1 中（5）與（3）比較修飾了Nafion/MWCNTs-COOH/GCE，峰電流增加了大約3 倍，是因為Nafion 是一種聚合物材料成膜覆蓋在MWCNTs 表面，防止MWCNTs 脫落進而導電性進一步增強。

通過研究在0.01V/s、0.03 V/s、0.05 V/s、0.07 V/s和0.09 V/s 下掃描速率修飾了Nafion/MWCNTs-COOH/GCE 的電極對MG 氧化峰電流值的影響，結果表明：隨著掃描速度的增加，氧化峰電流均增加，得到的氧化峰電流值與掃描速率的平方根成線性關系：Ip（μA）=87.313v1/2（V1/2s-1/2）-3.016（R2=0.982）（圖2），表明MG 在電極表面的反應過程屬于擴散控制。

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 電解質的確定以及濃度的選擇

研究發現0.1mol/L 檸檬酸緩沖溶液、0.2mol/L磷酸緩沖溶液作為電解質時在0.3～1V 電位之間出現兩個氧化峰。這與劉原瑗等[27]用納米金-殼聚糖/多壁碳納米管修飾的玻碳電極利用磷酸緩沖溶液做電解質的結果一致，而LiCl 作為電解質在此電位區間只出現一個氧化峰且峰電流較大，推測MG在緩沖溶液中發生二次氧化，而在LiCl 作為電解質中只發生一次氧化。對LiCl 電解質濃度進行優化，選擇濃度為0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L 和0.3mol/L LiCl 為電解質測定MG 氧化峰電流值（圖3）。結果表明：隨著氯化鋰濃度的增大，氧化峰電流值在一定范圍內也增大，在0.2mol/L時，氧化峰電流最大，隨著LiCl 濃度再增大，氧化峰電流趨于平穩，所以選擇0.2mol/L LiCl 為電解質。

2.2.2 富集時間的確定

對不同富集時間（0min、3min、5min、7min、10min、15min 和20min）對MG 氧化峰電流值的影響研究（圖4）表明：在小于10min 上，隨富集時間的延長，MG 氧化峰電流值增大；大于10min 時，峰電流趨于平穩，說明富集到10min 時MG 的吸附量最大，所以確定富集時間為10min。

2.2.3 表面活性劑的確定及其濃度選擇

研究CPB、SDS、CTAB 三種表面活性劑對MG的氧化峰電流值的影響，按照1.3.2 的相同濃度（5.0×10-5mol/L）配制這三種表面活性劑。由圖5 可知，含CPB 和CTAB 的MG 標準溶液促進了MG 的溶解和傳質，導致MG 氧化峰響應電流增大，且CPB 的效果較好，而加入含SDS 的MG 標準溶液，MG 氧化峰電流減小，是因為SDS 陰離子表面活性劑與標準溶液中的陽離子相結合后阻礙了在電極表面的吸附，所以選擇CPB 為表面離子活性劑。

同時研究了不同濃度CPB 對MG 氧化峰電流的影響，MG 氧化峰電流在3×10-5～7×10-5mol/L范圍內隨著CPB 濃度增加而增大，隨著CPB 繼續增大，MG 氧化峰電流減小，因為少量CPB 改變了液體的表面性質，有利于MG 的傳質與溶解，隨著CPB 再增加，CPB 陽離子表面活性劑與帶正電荷的MG 為競爭作用，更多的CPB 吸附在電極表面，導致MG 的吸附量減小。其結果（圖6）與Li 等[28]和Rahman 等[29]在標準溶液中加入表面活性劑結果一致，所以表面離子活性劑CPB 的濃度為7×10-5mol/L。

2.2.4 修飾配比及修飾量的選擇

Nafion/MWCNTs-COOH 混合液的用量影響MG氧化峰電流值，在7×10-5mol/L CPB 的MG 標準溶液中富集10 min 后,再在0.2 mol/L LiCl 電解質中測定，研究了Nafion 與MWCNTs-COOH 的體積比為0∶1、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1 和4∶1 時，二者體積比為1 時氧化峰電流最大，0∶1、1∶4、1∶2、1∶1對應氧化峰電流值逐漸增大，是因為隨著Nafion 量的增加，更多MWCNTs-COOH 被固定；隨著Nafion比例繼續增大氧化峰電流值反而減小，是因為Nafion 膜越厚反而阻礙了MG 的傳質（圖7）。所以選擇Nafion∶MWCNTs-COOH 為1∶1。就修飾量而言，分別在玻碳電極表面中心滴涂1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL 和9μL，用量為4～6 μL為宜，峰電流較大，同時考慮電極表面積有限，確定修飾量為5μL。

2.3 MG 標準曲線

在優化實驗條件下依次測定0.3×10-6mol/L、1×10-6mol/L、3×10-6mol/L、5×10-6mol/L、7×10-6mol/L、9×10-6mol/L 的MG 標準溶液，發現隨著濃度的減小氧化峰電流減小，且在3×10-7～9×10-6mol/L 時滿足線性關系：ip（μA）=0.207CMG（μmol/L）+3.158，（R2=0.985），檢測限為6×10-8mol/L（S/N=3）（圖8）。Sacara 等[30]用Nafion/CeO2和1%SDS 表面活性劑修飾玻碳電極，采用差分脈沖測定水樣中的MG，檢測限為1.025×10-6mol/L。

2.4 加標回收率

在養殖水樣中未檢測到MG，將水樣經過0.2μm濾膜過濾處理后作為樣品，進行加標回收率的實驗。在優化條件下對三個加標量分別測定三次取平均值，得到加標回收率在95.9%～98.7%（表1）。

表1 回收率結果（n=3）Tab.1 Results of MG recovery test（n=3）

2.5 Nafion/MWCNTs/GC 納米傳感器的穩定性和重現性

用同一修飾電極連續7 次測定1.0×10-4mol/L標準溶液的濃度，MG 測定結果的相對標準偏差（RSD）小于3.4%。按制備方法平行制備3 支修飾電極，對1.0×10-4mol/L 標準溶液測定結果的RSD 小于6.0%。將電極在室溫下放置7d 后重新測定相同濃度的MG，電流為原來的95%。以上結果說明,修飾Nafion/MWCNTs-COOH/GCE 具有較好的重現性和穩定性。

2.6 抗干擾實驗

在標準溶液中加入3 倍LMG、10 倍Ca2+、Cl-、Na+、K+、Mg2+，用修飾液Nafion/MWCNTs-COOH/GCE檢測1.0×10-4mol/LMG 標準溶液。發現金屬離子以及LMG 并沒有影響MG 的檢測。說明該電極對MG的檢測有一定的選擇性，其原因是MG 發生質子化，形成帶正電荷的共軛環狀結構與放大信號的Nafion/MWCNTs-COOH 結合容易發生電化學反應，而LMG 不帶電荷不易發生反應，因此不會對MG的檢測有影響。

3 結論

用Nafion 和MWCNTs-COOH 制備了Nafion/MWCNTs／GC 電化學納米傳感器，研究了MG 的電化學性質。發現MG 的電化學反應為一不可逆的電化學氧化還原的擴散控制過程；優化了納米電化學傳感器的制備和檢測條件，確定了Nafion/MWCNTs／GC 電化學納米傳感器法快速測定食品中MG的校正曲線、線性范圍、檢測限、加標回收率等參數。該電化學納米傳感器制作方法簡單，具有良好的重現性、穩定性和抗干擾性能。Nafion/MWCNTs/GC 電化學納米傳感器法可用于養殖水中MG的快速檢測，具有靈敏度高、檢測時間短、樣品處理簡單等優點。