HPLC法測定吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量

羅芳，李巖，郭曉茹，汪阿鵬，夏桂民

·論著·

HPLC法測定吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量

羅芳*，李巖*，郭曉茹，汪阿鵬，夏桂民

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所制劑研究室

建立吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量測定方法。

采用 HPLC 法測定脂質(zhì)體中主藥的含量并進行系統(tǒng)的方法學驗證。

色譜分離度 R = 2.242，陰性對照無干擾；吉西他濱肉豆蔻酸酯在 5.52 ~ 116 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（= 0.9999）；低、中、高 3 種濃度的平均回收率分別為 96.8%（RSD = 0.49%，n = 3）、99.7%（RSD = 0.15%，n = 3）和 99.8%（RSD = 0.50%，n = 3）；日內(nèi)精密度 RSD = 0.28%（n = 6），日間精密度 RSD = 0.55%（n = 6）；流速在 0.99 ~ 1.01 ml/min 范圍內(nèi)變化時RSD = 1.19%（n = 9），柱溫在28 ~ 32 ℃之間變化時 RSD = 0.66%（n = 9）。

建立的方法簡便易行、穩(wěn)定、準確、專屬性強、耐用性好，可定量檢測吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量。

高效液相色譜； 含量測定； 分析方法驗證； 吉西他濱肉豆蔻酸酯； 脂質(zhì)體

吉西他濱屬細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于 S 期，是一種人工合成的胞嘧啶核苷衍生物[1]。作為一線化療用藥，吉西他濱對多種實體瘤治療效果顯著，尤其是對胰腺癌、非小細胞肺癌和乳腺癌，單一用藥或聯(lián)合其他抗癌藥物都能取得很好療效。

臨床常用的劑型為注射用鹽酸吉西他濱，但是其在體內(nèi)容易被胞嘧啶核苷脫氨酶等酶迅速降解（半衰期很短，僅為 8 ~ 17 min），成為無活性的雙氟脫氧尿苷（dFdU），因此，吉西他濱若要維持有效的藥物濃度就必須大劑量給藥[2-3]。美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡及歐洲腫瘤協(xié)會指南推薦的標準劑量 1000 ~ 1250 mg/m2，且 30 min 內(nèi)靜脈輸注完成。持續(xù)大劑量給藥導致較強毒副作用，如：呼吸困難、脫發(fā)、水腫、骨髓抑制、腎毒性、胃腸道反應、流感樣反應、過敏反應等[4-5]。

納米技術(shù)的發(fā)展為改善藥物體內(nèi)循環(huán)時間，增效減毒帶來了新希望。本課題組對吉西他濱進行結(jié)構(gòu)改造，設計并合成脂水分配系數(shù)適宜的改良型新藥吉西他濱肉豆蔻酸酯（dimyristoyl-gemcitabine，dmGEM，圖 1），再利用納米技術(shù)、以磷脂為基礎賦形劑構(gòu)建長循環(huán)脂質(zhì)體，規(guī)避體內(nèi)相關(guān)酶的降解，延長半衰期，增強療效，降低毒性，提高患者依從性，其臨床意義重大。目前，尚未見吉西他濱肉豆蔻酸酯納米制劑中主藥分析方法的相關(guān)報道，因此需要建立吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量測定法，便于吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體的定量分析。

圖 1 吉西他濱肉豆蔻酸酯化學結(jié)構(gòu)式（R = C13H17，分子式：C37H63F2N3O6，分子量：683.47）

Figure 1 Chemical structure of dimyristoyl-gemcitabine (R = C13H17，molecular formula: C37H63F2N3O6, molecular weight: 683.47)

本研究建立了簡便、專屬性強的 HPLC 法，并對該法進行了系統(tǒng)的方法學驗證[6-8]，證明該法適用于吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體的含量測定。本法對其他吉西他濱酯化物納米制劑的含量測定也具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

LC-20A 高效液相色譜儀和 Inerstil ODS-SP 色譜柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm）購自日本島津公司；R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士 Buchi 公司；XSE105 分析天平購自瑞士梅特勒公司；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；低溫光照儀購自藥物制劑國家研究中心。

吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體自制，批號2019031405、2019032101、2019032102、2019032103、2019032104、2019032105；吉西他濱肉豆蔻酸酯原料及工作對照品，批號 20190307，99.0%，本所合成室制備；聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（PEG2000-DSPE）和注射級膽固醇購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；色譜純甲醇購自美國 Fisher Scientific 公司；分析純二水合磷酸二氫鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑也均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 配制 PBS 緩沖液（pH 2.4 ~ 2.6） 參照中國藥典（2015），稱取 NaH2PO413.8 g，置于 2000 ml燒杯，加水適量，使之溶解，另量取 H3PO42.5 ml 滴加至上述溶液，再加水稀釋至 1000 ml，攪勻。用 H3PO4調(diào)節(jié) pH 至 2.53，得 PBS 緩沖液（pH 2.53），0.22 μm 濾膜抽濾，臨用前超聲脫氣 15 min，室溫放置備用。

1.2.2 吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液制備 精密稱取吉西他濱肉豆蔻酸酯2.50 mg，置于 50 ml 量瓶中，加入適量甲醇，超聲使其完全溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得 50 μg/ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液。

1.2.3 供試品溶液及空白對照溶液制備 精密量取 0.1 ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體溶液，置于 2 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分振蕩、搖勻，于 4 ℃ 12 000 ×離心 10 min，上清液即為供試品溶液。另精密量取 0.1 ml 空白脂質(zhì)體，同法操作，得空白對照溶液。

1.2.4 HPLC 法 色譜柱：Inerstil ODS-SP（5 μm，150 mm × 4.6 mm）；流動相梯度洗脫詳見表 1；流速 1.0 ml/min；檢測波長 254 nm；柱溫 30 ℃；進樣量 20 μl。

表 1 流動相梯度洗脫

1.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別取“1.2.2”和“1.2.3”項下吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液、供試品溶液及空白對照溶液適量，照“1.2.4”項下色譜條件操作，記錄色譜圖。

1.2.6 破壞性試驗 分別取吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體、吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液各 5 份，進行以下破壞試驗，再將各待測溶液注入高效液相色譜儀。

1.2.6.1 酸破壞 精密量取 2 ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，向其中加入 1 mol/L 鹽酸溶液0.5 ml，室溫下避光放置 0.5 h 后，再按“1.2.3”項下方法操作，得酸破壞供試品溶液。分別精密量取 2 ml 空白脂質(zhì)體和吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液，同法操作，得酸破壞空白對照溶液及酸破壞吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液。

1.2.6.2 堿破壞 精密量取 2 ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，向其中加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 0.5 ml，立即按“1.2.3”項下方法操作，得堿破壞供試品溶液。分別精密量取 2 ml 空白脂質(zhì)體和吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液，同法操作，得堿破壞空白對照溶液及堿破壞吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液。

1.2.6.3 氧破壞 精密量取 2 ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，向其中加入3% 過氧化氫溶液0.5 ml，室溫下避光放置 3 h 后，再按“1.2.3”項下方法操作，得氧破壞供試品溶液。分別精密量取 2 ml 空白脂質(zhì)體和吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液，同法操作，得氧破壞空白對照溶液及氧破壞吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液。

1.2.6.4 光破壞 精密量取 2 ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，向其中加入5% 葡萄糖溶液0.5 ml，在低溫光照儀[（4500 ± 500）lx]中照射0.5 h 后，再按“1.2.3”項下方法操作，得光破壞供試品溶液。分別精密量取 2 ml 空白脂質(zhì)體和吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液，同法操作，得光破壞空白對照溶液及光破壞吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液。

1.2.6.5 高溫破壞 精密量取 2 ml 吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，向其中加入5% 葡萄糖溶液0.5 ml，在 65 ℃水浴中避光加熱 0.5 h 后，再按“1.2.3”項下方法操作，得高溫破壞供試品溶液。分別精密量取 2 ml 空白脂質(zhì)體和吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液，同法操作，得高溫破壞空白對照溶液及高溫破壞吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液。

1.2.7 線性與范圍 分別精密稱取吉西他濱肉豆蔻酸酯對照品 8 份，用甲醇溶解，得 8 種不同濃度的吉西他濱肉豆蔻酸酯溶液（濃度范圍為 5.52 ~ 116 μg/ml）。照“1.2.4”項下條件操作，記錄峰面積，以吉西他濱肉豆蔻酸酯峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，建立回歸方程。

1.2.8 檢測限與定量限 精密量取吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體適量，用 5% 葡萄糖溶液遞倍稀釋，照“1.2.3”項下方法處理樣品，照“1.2.4”項下條件操作，進樣，并記錄峰面積，分別以信噪比為 3:1 和 10:1 時相應的吉西他濱肉豆蔻酸酯的量為檢測限和定量限。

1.2.9 重復性試驗 取同一吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體 6 份，照“1.2.3”項下方法處理樣品，照“1.2.4”項下條件進樣，并記錄峰面積。

1.2.10 精密度試驗 取同一吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，照“1.2.3”項下方法處理樣品，照“1.2.4”項下條件，同 1 天內(nèi)連續(xù)進樣 6 次，記錄吉西他濱肉豆蔻酸酯峰面積，計算日內(nèi)精密度 RSD。另取同一份吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，連續(xù) 6 d，每天同法處理并平行連續(xù)進樣 3 次，計算吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度的日間精密度 RSD。

1.2.11 回收率試驗 精密稱取吉西他濱肉豆蔻酸酯 5.5、5.0、4.5 mg 各 3 份，分別置于 50 ml 量瓶中，加甲醇適量并超聲使吉西他濱肉豆蔻酸酯完全溶解，再加空白脂質(zhì)體溶液 2.5 ml，用甲醇定量至刻度，搖勻，于 4 ℃、12 000 ×離心 10 min，得高、中、低 3 個濃度的供試品溶液。照“1.2.4”項下條件，分別進樣，記錄峰面積，按外標法求得吉西他濱肉豆蔻酸酯實測值與理論值之比，每個濃度平行測定 3 次，求得平均回收率。

1.2.12 耐用性試驗

1.2.12.1 流速變化的影響 將流速分別設置為 0.99、1.00、1.01 ml/min，取同一份供試品溶液，照“1.2.4”項下條件，記錄吉西他濱肉豆蔻酸酯保留時間與峰面積并依據(jù)外標法求得吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度。

1.2.12.2 柱溫對系統(tǒng)的影響 將柱溫分別設置為 28、30、32 ℃，取同一份供試品溶液，照“1.2.4”項下條件，記錄吉西他濱肉豆蔻酸酯保留時間與峰面積并依據(jù)外標法求得吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度。

1.2.13 含量測定 取 5 批不同批次的吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體，分別照“1.2.3”和“1.2.4”項下的條件和操作，吸取供試液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，并按照外標法計算主藥的含量（濃度）。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

在吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液及供試品溶液中，吉西他濱肉豆蔻酸酯的保留時間均約15.9 min，分離度為 2.242。同時，空白脂質(zhì)體對應色譜圖中相應保留時間處未見吸收峰（圖 2）。上述結(jié)果表明在已建立的色譜條件下，吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體的輔料對吉西他濱肉豆蔻酸酯的測定無干擾。

我國為了緩解交通壓力，建立了各種橋體，如城市立交橋、高架橋、過街天橋等。城市綠化的相關(guān)工作人員可以利用這一條件，在橋身和立柱上設計種植槽和垂掛吊籃。目前，在橋面與橋身上可以設置金銀花、牽牛花等植物，在橋柱上則可以配置一些凌霄、爬山虎等攀援植物，這種綠化形式可以在不影響駕駛員駕駛的情況下，起到美化城市和凈化空氣的作用。

1：吉西他濱肉豆蔻酸酯；a：吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體；b：空白脂質(zhì)體；c：溶媒；d：吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液

Figure 2 Chromatograms of system suitability

1：吉西他濱肉豆蔻酸酯；a：空白脂質(zhì)體；b：吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體；c：吉西他濱肉豆蔻酸酯對照溶液

Figure 3 Typical chromatograms of destructive test [Destruction by acid (A); by base (B); by oxidation(C); by illumination (D); by high temperature (E); nondestruction (F)]

2.2 破壞性試驗

分別取各待測溶液，照“1.2.4”項下操作，記錄色譜圖（圖 3）。結(jié)果表明，吉西他濱肉豆蔻酸酯色譜峰遇酸、氧、光、高溫破壞產(chǎn)生的降解產(chǎn)物色譜峰均能有效分離，說明本方法專屬性良好。堿破壞試驗組均未檢測出吉西他濱肉豆蔻酸酯色譜峰，加入堿后均出現(xiàn)大量氣泡，表明其對堿極不穩(wěn)定。

2.3 線性與范圍

以吉西他濱肉豆蔻酸酯峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程：= 14721– 11435，= 0.9999，結(jié)果見表 2 和圖 4。

2.4 檢測限與定量限

經(jīng)檢測，吉西他濱肉豆蔻酸酯的檢測限為2.0 ng（S/N = 3），定量限為 8.4 ng（S/N = 10）。結(jié)果見圖 5 和圖 6。

2.5 重復性試驗

取同一吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體 6 份，經(jīng)統(tǒng)計，吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度的 RSD = 0.74%（n = 6）（表 3）。

表 2 線性與范圍

圖 4 線性與范圍

Figure 4 Linear and range

圖 5 檢測限色譜圖

Figure 5 Limit of detection chromatogram

圖 6 定量限色譜圖

Figure 6 Limit of quantification chromatogram

表 3 重復性試驗

2.6 精密度試驗

統(tǒng)計得吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度的日內(nèi)精密度 RSD 為 0.28%（n = 6），吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度的日間精密度 RSD 為 0.55%（n = 6）（表4 和表 5）。

2.7 回收率試驗

統(tǒng)計求得高、中、低 3 個加樣平均回收率為 96.8%（RSD = 0.49%，n = 3）、99.7%（RSD = 0.15%，n = 3）和 99.8%（RSD = 0.50%，n = 3）（表 6）。

表 4 日內(nèi)精密度

表 5 日間精密度

表 6 回收率試驗結(jié)果統(tǒng)計

2.8 耐用性試驗

流速在 0.99 ~ 1.01 ml/min 范圍內(nèi)變化時，吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度的 RSD 為 1.19%（n = 9）（表 7），說明該方法的耐用性良好。柱溫在 28 ~ 32 ℃之間變化時吉西他濱肉豆蔻酸酯濃度的 RSD 為 0.66%（n = 9）（表 7），說明柱溫在 28 ~32 ℃之間變化時對吉西他濱肉豆蔻酸酯含量測定結(jié)果的影響在可接受范圍內(nèi)。

2.9 含量測定

5 批脂質(zhì)體含量測定結(jié)果見表 8。

表 7 耐用性試驗結(jié)果統(tǒng)計

表 8 五批吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品提取方法及脂質(zhì)體破乳劑用量倍數(shù)的選擇

脂質(zhì)體中主藥的含量需采用適當?shù)姆椒ㄆ茐闹|(zhì)體雙分子層，使藥物釋放出來，再用 HPLC 法測定其含量。用有機溶劑破乳是目前常用的破壞脂質(zhì)體雙分子層的方法。吉西他濱肉豆蔻酸酯在非極性溶劑（如甲醇）中具有較好的溶解性，同時甲醇也為 HPLC 法中常用的有機相，因此本實驗選擇甲醇作為溶劑，破乳的同時，也能將主藥充分溶解提取，便于后續(xù)的含量測定。

脂質(zhì)體破乳完全與否對準確測定脂質(zhì)體中主藥的含量至關(guān)重要。破乳時有機溶劑加入倍數(shù)太低可能導致脂質(zhì)體破壞不完全，藥物提取不充分，測得含量偏低；有機溶劑加入倍數(shù)太高可能會導致主藥被過量稀釋，測得含量不準確，因此需要選擇合適的破乳劑用量（倍數(shù)）。在實驗中我們設計了 5、10、20、30、40、50和 60 倍的破乳倍數(shù)，當破乳 20 倍時，繼續(xù)增加破乳倍數(shù)，測得含量不再增加且藥物收率大于 99%，表明破乳劑用量 20 倍時，能破乳完全且能將主藥充分溶解并提取，且又能準確定量檢測。因此，我們將最佳破乳劑用量倍數(shù)確定為 20。

3.2 藥物穩(wěn)定性的影響因素

在本文的專屬性實驗過程中發(fā)現(xiàn)，吉西他濱肉豆蔻酸酯在酸、光和高溫下不穩(wěn)定，而吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體在酸、光和高溫下較穩(wěn)定，表明脂質(zhì)體對藥物的包封包載能夠保護藥物免于某些條件的降解破壞，體現(xiàn)了脂質(zhì)體具有穩(wěn)定藥物的優(yōu)點。同時，在建立的色譜條件下，主藥色譜峰與破壞產(chǎn)生的降解產(chǎn)物色譜峰均能有效分離，說明本方法專屬性良好。

本研究建立 HPLC 法用于吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中吉西他濱肉豆蔻酸酯含量的測定，通過系統(tǒng)的方法學研究與驗證，認為本方法操作簡便、專屬性好、準確度高，適合于吉西他濱肉豆蔻酸酯脂質(zhì)體中主藥的含量測定。本方法對其他吉西他濱酯化物納米制劑的含量測定具有參考價值。

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Determination of the principal agent in dimyristoyl-gemcitabine liposomes by HPLC

LUO Fang, LI Yan, GUO Xiao-ru, WANG A-peng, XIA Gui-min

Pharmaceutics Department, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To establish an HPLC method for the quantification of the principal agent in dimyristoyl-gemcitabine liposomes.

HPLC method was used to determine the content of the principal agent in liposomes and systematic methodological verification was performed.

The method was validated: with a resolution of 2.242; linear, in the range of 5.52 - 116 μg/ml (= 0.9999) and accurate, with the average recovery rate of 96.8% (RSD = 0.49%, n = 3), 99.7% (RSD = 0.15%, n = 3) and 99.8% (RSD = 0.50%, n = 3) at low, medium and high concentrations; precision, intra-day and inter-day precision reflected by the relative standard deviation (RSD) values of 0.28% (n = 6) and 0.55% (n = 6) respectively, robust under slight changes of flow rate (0.99 - 1.01 ml/min) and column temperature (28 - 32 ℃) with RSD of 1.19% (n = 9) and 0.66% (n = 9), respectively.

A simple, selective, sensitive and robust HPLC method has been established for the determination of the principal agent in dimyristoyl-gemcitabine liposomes.

HPLC; Determination; Validation; Dimyristoyl-gemcitabine; Liposome

XIA Gui-min, Email: xiaguimin@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.010

國家重點研發(fā)計劃（2016YFA0201504）；國家自然科學基金（81673383、81603063）；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程（2016-12M-3-013）

夏桂民，Email：xiaguimin@126.com

2019-11-14

*同為第一作者