輔酶Q10脂質體的制備及其抗紫外線損傷的作用

吳海游 吳怡 吳鐵

[摘要]目的 研究輔酶Q10脂質體的制備及其抗紫外線損傷的作用。方法 采用乙醇注入法制備輔酶Q10脂質體。然后進行動物實驗，將32只SPF級小鼠隨機分成正常（CON）組、模型（MOL）組、輔酶Q10脂質體（COQ）組、二氧化鈦（TiO2）組，每組各8只。CON組小鼠脫毛后不作任何處理，其余組小鼠脫毛后每天涂抹相應霜劑并進行紫外線照射，其中MOL組涂抹空白霜劑，COQ組涂抹輔酶Q10脂質體，TiO2組涂抹TiO2霜劑，照射劑量為最小紅斑量，實驗持續8周，結束后進行小鼠皮膚病理學觀察與丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、基質金屬蛋白酶（MMP-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量測定。結果 輔酶Q10脂質體最優處方為溫度60°C、水相pH 7.7、輔酶Q10百分比0.9%、卵磷脂百分比1.6%，其包封率為44.7%，且脂質體大小均勻，成球狀。MOL組小鼠皮膚組織的MDA含量與MMP-1相對表達量均高于CON組，SOD含量低于CON組，差異有統計學意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的SOD含量高于MOL組，MMP-1相對表達量低于MOL組，差異有統計學意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的MDA含量低于MOL組，差異有統計學意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的GSH-Px含量高于其他各組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 制備的輔酶Q10脂質體大小均勻，且具有抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用。

[關鍵詞]輔酶Q10;脂質體;紫外線損傷

[中圖分類號] R965? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）3（c）-0004-05

Preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect

WU Hai-you1，2? ?WU Yi2? ?WU Tie2，3

1. Dongguan Food and Drug Inspection Institute， Guangdong Province， Dongguan? ?523808， China; 2. Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang? ?524023， China; 3. Coenzyme Q10 Joint Research Center， Guangdong Medical University-Guangdong Runhe Biotechnology Co.， Ltd.， Guangdong Province， Dongguan? ?523808， China

[Abstract] Objective To study the preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect. Methods The coenzyme Q10 liposomes were prepared by injecting ethanol， then animal experiments were performed. A total of 32 SPF mice were randomly divided into normal （CON） group， model （MOL） group， coenzyme Q10 liposome （COQ） group， and titanium dioxide （TiO2） group， 8 mice in each group. The mice in the CON group were not subjected to any treatment after depilation， and the remaining groups of mice were smeared with the corresponding cream and irradiated with ultraviolet rays every day after depilation. Among them， the MOL group was smeared with the blank cream， the COQ group was smeared with the coenzyme Q10 liposome， and the TiO2 group was smeared with the TiO2 cream. The irradiation dose was the minimum amount of erythema， and the experiment lasted 8 weeks. After the end of the experiment， the skin pathology and the contents of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， and matrix metalloproteinase （MMP-1）， glutathione peroxidase （GSH-Px） in the mice were determined. Results The optimum formulation of coenzyme Q10 liposome showed as the temperature was 60°C， the water phase of pH was 7.7 and other was 0.9% of coenzyme Q10 and 1.6% of lecithin. The encapsulation efficiency of coenzyme Q10 liposome was 44.7%， and the liposome was uniform in size and globular. The MDA content and the relative expression of MMP-1 in skin tissue of the mice in the MOL group were higher than those in the CON group， and the SOD content was lower than that in the CON group， with statistically significant differences （P<0.05）. The SOD content in the skin tissue of the mice in the COQ group was higher than that in the MOL group， and the relative expression of MMP-1 was lower than that in the MOL group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MDA content in the skin tissue of the mice in the TiO2 group was lower than that in the MOL group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The GSH-Px content in the skin tissue of mice in the COQ group was higher than that in other groups， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion The prepared coenzyme Q10 liposome is uniform in size and has anti-ultraviolet damage effect on mice skin.

[Key words] Coenzyme Q10; Liposome; Ultraviolet damage

輔酶Q10俗稱泛醌，是機體能量ATP供應的重要有機酶[1]。隨著對輔酶Q10的不斷研究，發現其在眾多領域中均有藥用價值，其中在皮膚老化保護方面，輔酶Q10含量可以作為衡量皮膚健康與否的重要指標[2-3]。本研究前期發現三種含輔酶Q10的防曬霜具有抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用，這是由防曬劑與輔酶Q10聯合作用的結果[4]。那單獨使用輔酶Q10能否達到抗皮膚紫外線效果呢？輔酶Q10作為一種大分子物質，分子量為863.36，而皮膚作為人體的第一道防線，輔酶Q10要直接透過表皮層比較困難[5-6]。所以借用脂質體載體，將輔酶Q10包裹，根據脂溶性物質相似相容性原理，脂質體透過表皮層發揮輔酶Q10的作用。目前已有文獻報道運用脂質體載體可以將藥物“運輸”進真皮層發揮抗皮膚光損傷的作用[7]。本研究旨在研究輔酶Q10脂質體的制備及其抗紫外線損傷的作用，現報道如下。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑? 輔酶Q10（批號：2017052405）由廣東潤和生物科技有限公司提供;60%大豆卵磷脂（PC60，批號：20160410）購于海愛康精細化工;膽固醇、聚山梨酯80、無水乙醇、鹽酸、PBS購于國藥試劑;丙二醛（MDA）測試盒（批號：201802640）、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號：201712880）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（批號：201812041）、伊紅-蘇木精（HE）染色試劑盒（批號：201803930）購于南京建成公司;RT-qPCR反逆轉錄試劑盒（批號：201705467）與SYBR熒光染料購于TaKaRa公司。

1.1.2儀器? PCR擴增儀（Thermo公司）;UVB紫外燈及ST-513型紫外線輻照計（臺灣先馳光電公司）;電子天平（上海民橋）;雷磁實驗室pH計（上海精密儀器公司）;200 kV場發射透射電子顯微鏡（Tecani G2 F20 S-TWIN型）;酶標儀（中國普朗公司）;微量移液器（美國Thermo公司）、冷凍離心機（德國eppendorf公司）。

1.2輔酶Q10脂質體的制備

首先按一定比例精確稱取輔酶Q10、PC60、膽固醇、聚山梨酯80、無水乙醇，55°C水浴攪拌20 min至完全溶解得到油相;再配制PBS溶液，作為水相，并于55°C恒溫磁力低速攪拌，待油相攪拌完成后，用注射器將油相快速注射入水相中，并將水相攪拌速度提升至1000 r/mim、溫度不變攪拌20 min，攪拌完成后即用顯微鏡觀察是否有脂質體生成，將得到的脂質體溶液自然冷卻到室溫，保存在合適條件下[8]。

1.3包封率（encapsulation efficiency，EE）計算

標準溶液的配制：準確稱取輔酶Q10標準品10.00 g，溶解于無水乙醇中，并置于50 ml容量瓶中定溶，計算標準品溶液在300 nm波長處的吸光度值，多次測量求出平均值;樣品處理：把制得的樣品在4℃ 8000 r/min離心30 min，再取少量上清液用微孔濾膜過濾，這使得濾液中不含脂質體，用無水乙醇稀釋濾液，最后在300 nm波長處測量稀釋液的吸光度值，根據標準品吸光度值計算EE。

1.4正交處方優化

以EE為考察標準，以制備溫度（A）、水相pH值（B）、輔酶Q10百分比（C）、PC60百分比（D）4個因素作為考察因素進行正交處方優化，每個因素設置3個水平，按L9（34）正交表進行正交實驗設計（表1）。

1.5實驗動物造模

32只SPF級3月齡雌性KM小鼠，由南方醫科大學實驗動物中心提供，體重（27.41±0.57）g，動物合格證：SCXK（粵）2011-0015，各小鼠均自由飲食。實驗開始前，將小鼠背部皮膚進行物理脫毛，面積約為2×3 cm2，再隨機分成四組，即正常（CON）組、模型（MOL）組、輔酶Q10脂質體（COQ）組、二氧化鈦（TiO2）組，每組各8只。正常組小鼠脫毛后不作任何處理，其余組小鼠脫毛后每天涂抹相應霜劑并進行紫外線照射，其中MOL組小鼠涂抹空白霜劑，COQ組小鼠涂抹輔酶Q10脂質體，TiO2組小鼠涂抹TiO2霜劑，照射劑量為最小紅斑量[9]，連持8周[10-11]，每周稱量體重1次，實驗結束后小鼠眼球取血處死，剪下皮膚進行指標檢測。

1.6小鼠皮膚組織MDA、SOD、GSH-Px的測量

實驗結束后，剪取3 g左右皮膚組織放進勻漿管中加入適量生理鹽水進行冷凍勻漿，待組織塊充分勻漿后4℃ 12 000 r/min 離心15 min，取離心管上層液，參照試劑盒提供的檢測方法對小鼠皮膚MDA、SOD、GSH-Px進行檢測，并計算其含量。

1.7小鼠皮膚病理學切片染色

實驗結束后，剪下小鼠背部脫毛部位皮膚進行多聚甲醛固定、石蠟包埋，再進行HE染色，染色方法詳細參照染色試劑盒說明書。

1.8小鼠皮膚組織基質金屬蛋白酶（MMP-1）表達水平的檢測

實驗結束后，剪取3 g皮膚組織用Trizol進行勻漿，提取組織RNA，再參照RT-qPCR反逆轉錄試劑盒方法進行RNA轉錄，最后在SYBR熒光顏料的作用下PCR擴增儀進行基因相對表達量檢測[12]。

1.9統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1脂質體制備方法的優選

初步確定制備工藝為溫度、輔酶Q10投藥量、大豆卵磷脂投入比例、水相pH為制備主干擾因素，設計一種四因素三水平正交實驗進行處方優化，具體實驗結果見表2，在溫度的3個水平中（50、55、60°C）經試驗發現60°C時效果較理;在pH的3個水平中（7.7、7.9、8.1）經試驗發現pH為7.7時效果較理想;在輔酶Q10百分比的3個水平中（0.7、0.8、0.9%）經試驗發現0.9%時效果較理想;在PC60百分比的3個水平中（1.3、1.6、1.9%）經試驗發現1.6%時效果較理想。最優處方：溫度為60°C、水相pH為7.7、輔酶Q10質量百分比為0.9%、PC60質量百分比為1.6%。

2.2脂質體電鏡觀察圖

輔酶Q10脂質體在電鏡下拍攝如圖1所示，在電鏡下脂質體清晰可見，大小分布均勻，成球狀。

2.3各組小鼠每周體重的變化

實驗期間各組小鼠體重變化如圖2（封三）所示，CON、MOL組大鼠體重呈現先降低后增高的趨勢，最后處于穩定狀態，COQ、TiO2組大鼠體重則呈現一直增長，最后處于穩定的趨勢。

2.4各組小鼠皮膚組織MDA、SOD、GSH-Px含量的比較

MOL組小鼠皮膚組織的MDA含量高于CON組，SOD含量低于CON組，差異有統計學意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的SOD含量高于MOL組，差異有統計學意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織MDA的含量低于MOL組，差異有統計學意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的SOD含量低于COQ組，差異有統計學意義（P<0.05）;MOL組小鼠皮膚組織的GSH-Px含量低于CON組，COQ組小鼠皮膚組織的GSH-Px含量高于其他各組，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

2.5各組小鼠皮膚組織病理切片染色的結果

各組小鼠皮膚組織病理切片染色如圖3（封三）所示，CON組小鼠表皮層完整，厚度均勻;MOL組小鼠表皮層脫落嚴重，厚度較厚;COQ組小鼠表皮層完整，厚度較薄;TiO2組小鼠表皮層稍微脫落，厚度大小均一。

2.6各組小鼠皮膚組織MMP-1相對表達量的比較

MOL組小鼠皮膚組織的MMP-1相對表達量高于CON組，差異有統計學意義（P<0.05）;COQ組小鼠皮膚組織的MMP-1相對表達量低于MOL組，差異有統計學意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的MMP-1相對表達量高于CON組，差異有統計學意義（P<0.05）;TiO2組小鼠皮膚組織的MMP-1相對表達量高于COQ組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

3討論

輔酶Q10是一種泛醌，其分子量達到863.36，單獨穿透皮膚表皮層的難度較大，所以本研究采用脂質體作為運輸載體。脂質體是由卵磷脂和神經酰胺等制得的空心體，具有的雙分子層結構與皮膚細胞膜結構相同，是一種很好的穿透皮膚運輸載體[13-14]。但脂質體的制備受到多種因素干擾，其中包括：投藥量百分比、水相pH值、卵磷脂百分比、溫度等[15]，想要選擇一種EE適合的處方需要經過一定的摸索探討，本實驗采用了四因素三水平的正交實驗以獲得最佳處方。當溫度從低溫往高溫變化時，輔酶Q10 EE出現波動性變化，但考慮投入與效率等方面的因素，這里選擇60°C為最佳溫度。在水相pH三個因素下，當其從低往高變化時，輔酶Q10平均EE逐漸降低，所以選擇7.7為最佳水相pH。輔酶Q10的投藥量則跟水相pH呈現相反特點，當其從低往高變化時，輔酶Q10平均EE逐漸減升高，所以選擇投藥量百分比為0.9%。最后，PC60投入量百分比在1.6%與1.9%時，輔酶Q10 EE較理想，但考慮投入與效率等方面的因素，這里選擇投入量百分比1.6%。所以經正交實驗表獲得最佳處方：溫度為60°C、水相pH 7.7、輔酶Q10百分比為0.9%、PC60百分比為1.6%。根據該處方制備的輔酶Q10脂質體大小分布均勻，成球狀，是一種較理想的輔酶Q10劑型。

輔酶Q10脂質體是一種油相包裹輔酶Q10的制劑，可以快速地將輔酶Q10“運輸”進皮膚。然而關于脂質體是如何將輔酶Q10“運輸”進皮膚的作用機制目前尚未清楚，目前認為輔酶Q10脂質體可能通過以下幾種機制進入皮膚：水合機制、融合機制、穿透機制。水合機制認為脂質體可能通過增加角質層濕化和水合作用，改變角質細胞間結構，促使藥物通過擴散等作用進入細胞間質[16]。融合機制認為脂質體的主要成份磷脂科與表皮脂質層融合，改變其組成，形成一種扁平的顆粒狀結構，使其屏障作用發生逆轉，載藥脂質體則可順利通過表皮[17]。穿透機制認為由于皮膚表面和內部存在的水濃度差異能為脂類載體穿透皮膚提供動力來源，這就使得脂質體能順利穿脫皮膚。在本實驗中，當輔酶Q10脂質體能順利透過皮膚，發會輔酶Q10的抗紫外線損傷作用。皮膚組織生化指標結果顯示，輔酶Q10脂質體小鼠皮膚組織MDA含量明顯降低，SOD與谷胱甘肽活力明顯升高，而TiO2組小鼠皮膚組織的SOD與谷胱甘肽活力均低于COQ組（P<0.05），提示輔酶Q10能有效發揮抗紫外線作用，其作用效果比TiO2優。輔酶Q10作為一種抗氧化劑，其可以清除皮膚組織自由基及抑制其產生的一系列連鎖反應。另外從皮膚病理切片與MMP-1表達量角度來看，輔酶Q10具有抗紫外線損傷作用。MMP-1及其相關通路在皮膚光老化中起重要作用，MMP-1能特異性降解幾乎所有細胞外基質成分，造成正常膠原成分和彈性纖維降解，導致皮膚光老化[18]，而有研究報道人真皮成纖維細胞在紫外線照射后主要產生MMP-1、MMP-3和MMP-9，并認為它們在光老化的過程中起很大的作用[19-20]。COQ組小鼠MMP-1皮膚組織MMP-1相對表達量比MOL、TiO2組低（P<0.05），提示輔酶Q10具有抗紫外線損傷作用，并且其作用比TiO2優。

綜上所述，正交實驗篩選出最優處方：溫度為60℃、水相pH為7.7、輔酶Q10百分比為0.9%、PC60百分比為1.6%，輔酶Q10脂質體能順利通過皮膚角質層發揮抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用，且效果比TiO2優。

[參考文獻]

[1]Acosta MJ，Vazquez Fonseca L，Desbats MA，et al.Coenzyme Q biosynthesis in health and disease[J].Biochim Biophys Acta，2016，1857（8）：1079-1085.

[2]張琰，宋金玉.輔酶Q10的應用研究進展[J].山西職工醫學院學報，2017，27（3）：57-59.

[3]邱楚群，梁美婷，江文菁，等.輔酶Q10聯合Q伴侶對模型大鼠皮膚氧化損傷的改善作用[J].中國藥業，2019，28（10）：9-12.

[4]吳海游，梁美婷，邱楚群，等.三種含輔酶Q10防曬劑抗小鼠皮膚紫外線損傷的效果評價[J].中國皮膚性病學雜志，2017，31（4）：365-368.

[5]Dragicevic N，Krajisnik D Milic J，et al.Development of hydrophilic gels containing coenzyme Q10-loaded liposomes： characterization，stability and rheology measurements[J].Drug Dev Ind Pharm，2019，45（1）：43-54.

[6]Laredj LN，Licitra F，Puccio HM.The molecular genetics of coenzyme Q biosynthesis in health and disease[J].Biochimie，2014，100（5）：78-87.

[7]李福民，劉媛，廖金鳳，等.維生素E脂質體對小鼠皮膚光損傷的修復作用[J].中國臨床藥理學雜志，2019，35（5）：465-467.

[8]趙國棟，夏強.輔酶Q10硫辛酸復配脂質體的制備與表征[J].食品與藥品，2014，16（3）：153-158.

[9]陳靜怡，張莉，姬文捷，等.脂質體鑲囊的研究進展[J].中國藥學雜志，2017，52（3）：173-179.

[10]Ding R，Li Z，Wang J，et al.Design and synthesis of galactose-biotin lipid materials for liposomes to promote the hepatoma cell-targeting effect[J].J Pharm Sci，2019，108（9）：3074-3081.

[11]袁雍，黃萍，楊秀麗.脂質體經皮局部給藥研究進展[J].中國藥師，2014，17（7）：1227-1231.

[12]彭浩，喬艷明，陳文強，等.用L9（34）正交實驗篩選富硒香菇液體培養基[J].北方園藝，2014，（15）：152-157.

[13]Benson HAE.Liposomes for topical and transdermal drug delivery[J].Curr Drug Deliv，2009，6（3）：217-226.

[14]Li ZH，Li YY，Hou M，et al.Topically applied hypericin exhibits skin penetrability on nude mice[J].Lasers Med Sci，2018，33（6）：1279-1286.

[15]Shim J，Kim MJ，Kim HK，et al.Morphological effect of lipid carriers on permeation of lidocaine hydrochloride through lipid membranes[J].Int J Pharm，2010，388（1-2）：251-256.

[16]Rattanapak T，Young K，Rades T，et al.Comparative study of liposomes，transfersomes，ethosomes and cubosomes for transcutaneous immunisation：characterisation and in vitro skin penetration[J].J Pharm Pharmacol，2012，64（11）：1560-1569.

[17]曹玉音，陳迎玉，王暉，等.輔酶Q10在活性氧相關疾病中應用研究進展[J].實用醫學雜志，2018，34（20）：3482-3485.

[18]林芳，馬良娟.金屬蛋白酶在皮膚光老化信號通路中的研究進展[J].臨床與病理雜志，2018，38（11）：2502-2507.

[19]Lee HJ，Hwang E，Park B，et al.Methanol extract of bitter melon alleviates UVB-induced MMPs expression via MAP kinase and AP-1 signaling in human dermal fibroblasts in vitro[J].Phytother Res，2016，30（9）：1519-1526.

[20]吳文伯，陳敏亮，吳焱秋，等.富血小板血漿（PRP）對大鼠光老化皮膚膠原蛋白、TGF-β及MMP-1表達的影響[J].中國美容醫學，2019，28（4）：64-67.

（收稿日期：2019-08-08? 本文編輯：任秀蘭）