化香果提取物體外抑菌活性研究

徐 曼, 汪詠梅, 張亮亮, 胡新宇

(中國林業科學研究院 林產化學工業研究所;生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室,江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心, 江蘇 南京210042)

近年來，我國水產養殖行業高速發展，對養殖飼料產生巨大需求。20世紀90年代，漁業生產嚴重依賴人工合成藥品，如抗生素、抗菌藥、抗球蟲藥和抗寄生蟲藥等。大量使用抗生素導致的耐藥性以及藥物殘留對人和動物的毒副作用引起了消費者和政府部門的關注和憂慮[1]。養殖飼料中抗生素產品的連續和無序使用還將導致耐藥菌株的快速出現以及將來無藥物使用的尷尬局面[2]。所以在當前狀況下，尋找具有相同功效，但是安全、純天然的植物源飼料添加劑受到科研工作者的重視。

化香樹(PlatycaryastrobilaceaSieb. et Zucc.)屬于胡桃科植物，廣泛分布于我國西北、華東、華中、華南等地?；銟湓谖覈耖g的應用廣且歷史悠久，樹葉搗爛加水過濾出的汁液可用做農藥，用來防治棉蚜、紅蜘蛛、甘薯金花蟲、菜青蟲、地老虎等。樹葉還可供藥用，能順氣、祛風、化痰、止痛、燥濕、殺蟲[3-4]?；愎崛∥飦碓从诨銟涔?，屬于天然產物，其中含有植物多酚、黃酮、鞣花酸、維生素等生物活性物質[5-6]。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)等廣泛存在于各種水體生態系統中，比如淡水、沿海水域以及污水中[7]。有的細菌不僅是嚴重危害水產動物的致病菌，也是一種人、魚共患病原菌，對養殖業的危害很大，也會對人類健康造成威脅[8]。研究人員對化香果資源進行了一系列的研究，發現化香果提取物具有特殊的生物學和藥理學活性，以及良好的抗氧化性[9-11]，同時也有研究表明化香樹及果序提取物對引起鼻炎和鼻竇炎等的致病菌可以起到抑制作用，還對抑制細胞毒性、預防癌癥和抗衰老有一定功效[12-13]，以及化香果提取物對水青石斑魚具有一定的促生長功效[14]。因此，本研究對化香果提取物的抑菌性能進行研究，測定了化香果提取物對水產動物幾種常見致病菌的最小抑菌濃度(MIC)，并且對化香果提取物的小鼠經口毒性進行測定，以期為化香果提取物作為水產飼料添加劑的應用提供前期理論依據。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

化香果提取物粉末，多酚質量分數72.0%，實驗室用水提取制備得到[10]。嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、遲鈍愛德華菌(E.tarda)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus),由集美大學水產學院提供。營養肉湯培養基(MHB)，青島高科園海博生物技術有限公司；氟苯尼考，上海聯邁生物工程有限公司。

無特定病原體級實驗動物(SPF級)健康ICR小鼠40只，雌雄各半，體質量18.2～22.0 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司南京分公司提供。

SYNERGY H1多功能酶標儀，美國BioTek公司；BE204E分析天平，梅特勒-托利多公司；SHP-250型生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；PYX-280S-B型生化培養箱，科力實驗儀器有限公司；高壓蒸氣滅菌鍋，日本Hirayama公司； MILLI-Q純水系統，上海摩速科學器材有限公司；超凈工作臺，上海博訊實業有限公司。

1.2 抑菌活性試驗

1.2.1細菌基本培養基的配制 稱取MHB培養基21.0 g溶于1 000 mL蒸餾水中，混勻，過濾，將過濾后的培養基分裝于試管內，121 ℃滅菌30 min后，備用。

1.2.2藥液配置 用超純水溶解化香果提取物至飽和狀態(質量濃度為18.0 g/L)，作為樣品母液，采用二倍稀釋法，根據實驗進行倍比稀釋，所得藥物質量濃度分別為18.00、 9.00、 4.50、 2.25、 1.13、 0.56、 0.28、 0.14和0.07 g/L。

1.2.3最小抑菌濃度(MIC)的測定 在大部分近似球形的細菌的最大吸收波長600 nm下，形狀規則的細菌菌液濃度和吸光度呈線性關系，所以測定大多數細菌時，通常會選擇測定波長600 nm下的菌液的吸光度，結合平板計數結果繪制出標準曲線，可以快速地根據吸光度計算菌液濃度。將9種受試菌株的單菌落用MHB培養基培養到對數生長期，用多功能酶標儀測定菌液吸光度(OD600)，根據所需的菌液濃度通過公式反推出適合的吸光度，再根據所需吸光度對菌液進行稀釋，將受試菌株用無菌生理鹽水調至合適的菌濃度。

以一株細菌為例。取無菌試管11支，編號1～11，每一試管中各加入配置好的MHB培養基1.0 mL，1～9號試管中分別加入質量濃度依次為18.00、 9.00、 4.50、 2.25、 1.13、 0.56、 0.28、 0.14、 0.07 g/L的化香果提取物溶液，每管藥液量100 μL；10號試管以無菌生理鹽水替代藥液，為陰性對照；11號試管以抗生素(氟苯尼考質量濃度為0.1 g/L)替代藥液，為陽性對照。而后，在每一試管中分別加入菌懸液100 μL。加樣后，于28 ℃培養(其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養溫度為37 ℃)。24 h后觀察各管情況：陰性對照試管中培養液應呈渾濁狀，表明細菌得以生長，陽性對照試管中培養液應為澄清、透明狀，表明細菌不生長；此時，再觀察其他的試管內培養液的情況，若呈渾濁，表明細菌的生長不被抑制；若為澄清、透明，則表示細菌被殺死或細菌生長被抑制。以細菌不生長時，藥物的最低稀釋質量濃度為該藥物對該菌的最小抑菌濃度。若陰性和陽性對照試管中培養液出現與預期結果不同的狀況，結果無效。如若無效則重新培養菌種重做實驗。

1.2.4抑菌率測定 在96孔板中加樣，同列添加的藥物質量濃度相同，同行添加的菌株相同，第一塊孔板添加質量濃度18.00、 9.00和4.50 g/L的樣品，第二塊孔板樣品質量濃度為2.25、 1.13和0.56 g/L，第三塊孔板樣品質量濃度為0.28、 0.14和0.07 g/L，每種質量濃度對某種菌株的樣本均進行一次重復。同時每種菌株設一個陰性對照和陽性對照(氟苯尼考)。每孔添加的藥物和菌液均為100 μL。加樣后，將細胞培養板放入多功能酶標儀中培養，嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌、遲鈍愛德華菌、副溶血弧菌、鼠疫耶爾森氏菌于28 ℃培養，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的孔板于37 ℃培養，每隔2 h測一次OD600，24 h后結束。根據測定的OD600數值考察是否與1.2.3節中試管實驗的觀察結果相同。將培養24 h的試驗菌液進行倍比梯度稀釋，分別稀釋至原體積的2倍和4倍，通過平板計數讀出每個質量濃度的藥液對應的菌落值。采用下式計算不同質量濃度化香果提取物的抑菌率。

抑菌率=(陰性對照菌數-實驗組的菌數)/陰性對照菌數×100%

1.3 小鼠經口毒性檢驗

根據GB 15193.3—2014《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗》的要求，采用霍恩氏法進行試驗。分別稱取化香果提取物粉末樣品2 150、 4 640、 10 000、 21 500 mg，對應加入20、 20、 30、 60 mL純凈水，充分混勻配制成溶液。將40只SPF級健康ICR小鼠分雌雄隨機分入2 150、 4 640、 10 000、 21 500 mg/kg體質量4個劑量組，每組5只。動物禁食6 h，飲水不限。最高劑量組受試物經口2次灌胃，間隔時間4 h，灌胃容量每次約為30 mL/kg體質量，其余劑量組受試物經口1次灌胃，2 150、 4 640 mg/kg 體質量劑量組灌胃容量約為20 mL/kg 體質量，10 000 mg/kg體質量劑量組灌胃容量約為30 mL/kg體質量。染毒后2 h給食。觀察期14 d，每天觀察并詳細記錄動物的中毒表現、死亡數和死亡時間。中毒死亡的和人道處死的動物，立即進行解剖檢查。

2 結果與分析

2.1 不同菌株菌懸液的吸光度值與活菌數間的關系

將培養約16 h的細菌培養物(處于對數生長期狀態)制成菌懸液，測其吸光度OD600，結合平板計數結果繪制出標準曲線，以便快速地根據吸光度計算相應的菌液濃度。本實驗所選擇的9種細菌的起始吸光度OD600約為0.28，其相應的活菌濃度分別為嗜水氣單胞菌4.0×108CFU/mL、溫和氣單胞菌7.0×108CFU/mL、豚鼠氣單胞菌5.0×108CFU/mL、維氏氣單胞菌5.0×108CFU/mL、遲鈍愛德華氏菌4.0×108CFU/mL、大腸桿菌4.6×108CFU/mL、金黃色葡萄球菌6.2×108CFU/mL、副溶血弧菌5.0×108CFU/mL、鼠疫耶爾森氏菌5.2×108CFU/mL。

2.2 化香果提取物對9種細菌的最小抑菌濃度

共設置9個質量濃度梯度，以測定化香果提取物對供試菌株的最小抑菌濃度，結果見表1。由表1可知，化香果提取物對9種供試菌株都具有抑制作用。對于供試的9種細菌，在化香果提取物質量濃度為2.25、 1.13、 0.56、 0.28、 0.14、 0.07 g/L的試管中培養液均呈渾濁，表明有細菌的生長；在質量濃度4.50、 9.00、 18.00 g/L的試管內培養液澄清、透明，表示細菌被殺死或細菌生長被抑制，即無菌生長。同時陰性對照管中細菌生長，呈均勻渾濁狀；陽性對照管無細菌生長呈透明狀。通過對各樣品質量濃度的培養液的OD600值考察，發現樣品質量濃度18.00、 9.00、 4.50 g/L的培養液的OD600值與初始值幾乎無變化，說明抑菌率達到100%，在2.25 g/L的樣品中培養24 h后培養液的OD600值比初始值大，說明有細菌生長。因此，無細菌生長的藥物最低質量濃度為4.50 g/L，即化香果提取物對9種供試菌的最小抑菌濃度為4.50 g/L。

表1 化香果提取物對9種菌株的最小抑菌濃度1)

1)+:有菌生長means turbidness with colonial growth；-:無菌生長means limpidity with no colonial growth

2.3 化香果提取物抑菌活性的濃度效應

表2為不同質量濃度化香果提取物對不同細菌的抑菌率。

表2 不同質量濃度化香果提取物的抑菌率

依據表2對化香果提取物質量濃度和抑菌率進行相關性分析，發現化香果提取物對9種供試菌株的抑制作用都是隨著提取物質量濃度的增加而增強，為進一步探究兩者關系，將得到的抑菌率與樣品質量濃度進行回歸分析，結果見圖1。由圖1可知，化香果提取物對9種供試菌株的抑制作用與提取物質量濃度呈對數式增長模式，對不同細菌的抑制效果有所不同，由圖1中各方程可以計算出化香果提取物對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的IC50值分別為0.106、 0.102、 0.099、 0.099、 0.072、 0.072、 0.072、 0.035、 0.053 g/L， IC50值越小，表示樣品的抑菌活性越高，化香果提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著高于對其他7種細菌的抑制作用。

a.副溶血弧菌V.parahaemolyticus； b.嗜水氣單胞菌A.hydrophila； c.遲鈍愛德華氏菌E.tarda;

2.4 小鼠經口毒性試驗結果

小鼠灌胃后約6 h，出現依劑量的精神萎靡、俯臥不動等中毒表現，約7 h開始出現死亡，全部中毒死亡發生在4 d內，具體結果見表3。

表3 小鼠死亡數及LD50值(95%可信限)

由表3可知，雌性小鼠4 640 mg/kg體質量劑量組有2只出現中毒表現，10 000、 21 500 mg/kg體質量劑量組中5只都出現中毒表現。雄性小鼠 21 500 mg/kg體質量劑量組中5只都出現中毒表現，各劑量組其余的存活小鼠5 d后逐漸恢復。中毒死亡和人道處死動物解剖未見明顯異常。通過GB 15193.3—2014《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗》中的附表霍恩氏法急性經口半數致死量(LD50)值計算表4，可以查出化香果提取物對雌雄小鼠LD50值分別為5 010(3 440～7 300)和7 940(5 840～10 800) mg/kg體質量，根據LD50值劑量分級表規定，小鼠口服LD50值大于5 000 mg/kg體質量即為實際無毒級，所以化香果提取物屬于實際無毒級。

3 結 論

3.1研究了化香果提取物對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌、遲鈍愛德華菌、副溶血弧菌、鼠疫耶爾森氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果表明化香果提取物對供試9種細菌均表現出抑制作用，抑菌效果隨質量濃度的增加而增強，對9種供試菌的最小抑菌濃度為4.50 g/L?；愎崛∥飳Υ竽c桿菌的抑制能力最強，IC50值為0.035 g/L；其次為金黃色葡萄球菌，IC50值為0.053 g/L。化香果提取物具有良好的抑菌活性。

3.2通過小鼠經口毒性實驗可以得出化香果提取物對雌雄小鼠急性經口半數致死量LD50值(95%可信限)分別為5 010(3 440～7 300)和7 940(5 840～10 800)mg/kg體質量，說明化香果提取物屬于實際無毒級，可以作為水產動物飼料添加劑開展進一步的安全性檢測和應用試驗。