生物殺蟲劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽與人血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究

陳佳佳，紀仁靜，潘衛東，田大雨，張國平

（淮北師范大學，安徽淮北235000）

0 引言

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（EmamectinBenzo?ate,EB）又稱甲維鹽，是一種生物合成農藥，其分子結構如圖1 所示。作為一種新型高效抗生素殺蟲劑，EB 因具有高活性、安全、低殘留等優勢而被廣泛使用［1-5］。

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，可與很多內源和外源物質結合，研究藥物與血清蛋白的相互作用，對于了解藥物的作用機理具有重要的生物學及臨床意義。近年來，人們已經做了許多蛋白質與藥物相互作用方面的研究，如牛血清白蛋白［6］、胰蛋白酶［7］、木瓜酶［8-9］等，而有關農藥小分子與蛋白質大分子相互作用的研究有關報道相對較少。本文采用熒光光譜法研究EB 與人血清白蛋白（HSA）的相互作用，探討它們的猝滅機理及結合常數、結合位點數、結合作用力類型。同時，采用同步熒光說明HSA 的構象是否發生變化。這對了解生物殺蟲劑EB 在人體內的代謝過程及藥物的毒理作用等方面具有一定的意義。

圖1 甲氨基阿維菌素的分子結構

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

TU1901 紫外可見光譜儀（北京，中國）；FP-8300 熒光光譜儀（日本）；PHS-23 型精密pH 計（上海虹益儀器儀表有限公司）；501 型超級恒溫箱（上海市實驗儀器廠）。

取0.2740 g EB（分析純試劑）稀釋于500 mL 的蒸餾水配制成5×10-4mol·L-1的EB儲備液；取0.3340 g HSA（65,000 Da,上海新興公司）溶解于250 mL 的蒸餾水配制成2×10-5mol·L-1的HSA 溶液，0.04 mol·L-1的H3PO4，HAc和H3BO3與0.20 mol·L-1的NaOH以相同的比例配制成B-R緩沖溶液（pH=7.40）,0.2mol·L-1NaCl 溶液，其他試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在10 mL 比色管中依次加入pH=7.40 的B-R緩沖溶液1 mL，2.0×10-5mol·L-1HSA 溶液1 mL，0.20 mol·L-1NaCl溶液2.5 mL以及一定量5×10-4mol·L-1EB 溶液，用蒸餾水稀釋至刻度后混勻，在一定溫度下反應30 分鐘，然后該溶液用1 cm 石英比色皿，激發波長278 nm，繪制300～500 nm 的熒光光譜，激發和發射狹縫寬度分別為5 nm和10 nm。

2 結果與討論

2.1 EB與HSA的熒光猝滅類型

任何降低熒光強度的過程都叫熒光猝滅［10］，分子重排、激發態反應、基態絡合物的形成、能量轉換以及碰撞猝滅中的分子間反應，都會導致猝滅。圖2為加入不同含量EB 后HSA 的光譜圖。隨著EB 的加入，HSA 的內源熒光強度逐漸降低，且314 nm～338 nm之間的最大發射波長藍移，說明EB與HSA之間發生了相互作用，使得HSA 中熒光發色團的微環境發生改變。隨著EB濃度的增加，體系在440 nm有明顯的峰值，這是EB 自身的峰值，而HSA 沒有這樣的特征峰，且此峰值對于EB 與HSA 之間的反應是沒有影響的，因此可以不用考慮。（λex=278 nm，λem=338 nm,CHSA=2×10-6mol·L-1;CEB（1-10）= 0,1.5,3,4.5,6,7.5,9,10.5,12,13.50×10-5mol·L-1）

圖2 EB-HSA體系的熒光光譜圖

為確定EB-HSA 內源熒光的猝滅機制，根據Stern-Volmer方程處理上述體系［11］：

其中，F0和F分別是EB 不存在與存在條件下HSA的熒光強度，［Q］是EB 的濃度，Kq是生物大分子的猝滅速率常數，Ksv是動態猝滅常數，τ0是生物大分子的平均壽命，一般為1×10-8s-1。

圖3 為F0/F與［Q］之間的關系圖。從圖中可以發現，當溫度分別為290 K，300 K 和310 K 時，隨著EB 濃度的增加，Stern-Volmer 曲線是線性的，表明EB-HSA 體系為單一猝滅機制，即動態猝滅或靜態猝滅［12-14］。體系的猝滅常數Ksv、Kq計算結果列于表1。計算得出的Kq量級為1011L·mol-1·s-1，這已經超過了最大擴散碰撞猝滅速度常數（2.0×1010L·mol-1·s-1）［15］，說明HSA的熒光猝滅過程是靜態猝滅過程［16］。

2.2 結合常數與結合位點數

在靜態猝滅過程中，獨立小分子將綁定到大分子的等同位置［17-18］。當小分子獨立綁定在大分子的等同位置時，自由分子與綁定分子之間的平衡可由方程（2）得出［19］，

其中，K是結合常數，n是結合位點數。

圖3 不同溫度下F0/F與［Q］的關系圖

表1 不同溫度下EB對HSA的熒光猝滅常數

對于EB-HSA 體系，在三種溫度下K與n的值可由圖4 中的截距與斜率得到，其計算結果列于表2。結果表明，EB與HSA作用時只有1個結合位點，并且隨溫度的升高結合常數增大［20］。

圖4 不同溫度下lg（F0-F）/F與lg［Q］的關系圖

表2 不同溫度下EB-HSA體系的Stern-Volmer猝滅常數

2.3 EB-HSA體系的結合方式

生物大分子與小分子之間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電作用與疏水作用等，其作用力的類型可根據反應的熱力學參數，如自由能（ΔG）、焓（ΔH）與熵（ΔS），加以判斷。ΔH＞0、ΔS＞0 分子間的作用力為典型的疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0為氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0為靜電作用力［21］。如果焓隨溫度改變不大，那么熵則由Van’t Hoff 方程決定：

其中，T是實驗溫度，K是相應的結合常數，R是氣體常數。對于EB-HSA 體系，lnK正比于1/T，ΔH和ΔS可由曲線的斜率與截距得到，不同溫度下吉布斯自由能（ΔG）可由方程（4）計算得到：

EB-HSA 體系的ΔG、ΔH和ΔS的計算結果列于表2。可知ΔG為負值、ΔS為正值表示結合過程是由焓、熵驅動的自發過程；同時ΔH為正值，則進一步表明EB 與HSA 之間主要的作用力是疏水作用力。

2.4 同步熒光光譜

同步熒光可用來說明生物大分子發光官能團受外源小分子加入后微環境的變化。HSA 的熒光性是由色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸殘基決定，其色氨酸和酪氨酸殘基的波長間隔（Δλ）分別是60 nm 和15 nm。圖5為EB與HSA作用的同步熒光光譜。隨著農藥小分子EB的加入，HSA中色氨酸的發光強度明顯減弱，而最大發射波長沒發生移動，見圖5（a），酪氨酸的發光強度及最大發射波長沒發生明顯變化，見圖5（b）。可知加入的EB 主要與HSA 中色氨酸殘基結合，且沒有使HSA的構象發生變化。

2.5 EB與HSA之間的能量轉換

根據F?rster’s 能量共振轉移理論［22］研究EB 在HSA 中的精確位置，體系的能量轉移是由HSA 的發射熒光與EB 的紫外光譜決定的（見圖6），EB 與HSA 之間的熒光猝滅說明體系發生了能量轉移，能量E可由方程（5）計算［23,24］：

其中，F0和F是EB 不存在與存在條件下HSA 的熒光強度，R是EB與HSA之間的距離，R0是臨界距離，其值由方程（6）計算得出：

圖5 EB-HSA體系的同步熒光光譜圖（a）：△λ=60 nm;

圖6 EB的紫外吸收光譜與HSA的熒光發射光譜的斜率

其中，K2是偶極子的空間去向因素，N是介質的折射率，Φ是熒光量子產率，J由方程（7）計算

F（λ）是HSA 在波長λ時的熒光強度，ε（λ）是EB在波長λ時的摩爾吸光系數，當λ=85 nm 時，K2=2/3,N=1.336,Φ=0.118［25］。

由以上方程得出數據：J=8.792×10-18cm3·L·mol-1,R0=0.759 nm,E=0.103，R=1.09 nm。EB 與HSA 的距離R＜7 nm［26］，表明EB 與HSA 之間發生了非輻射能量轉移，從而促使HSA內在熒光的猝滅。

3 結論

采用熒光光譜，在pH = 7.40 條件下研究EB 與HSA 之間的相互作用，實驗結果表明，EB 與HSA 之間是靜態猝滅方式；在300K 時，其結合常數K 為1.08×104L-1·mol-1，結合點n為1.1，說明EB 與HSA之間有中等強度的結合作用；熱力學參數ΔH＞0，ΔS＞0，表明EB與HSA之間的作用力主要是靠疏水作用引起的。同步熒光光譜顯示EB 與HSA 之間絡合時沒有引起蛋白構象的改變；通過紫外和熒光光譜計算出EB 與HSA 之間的間距為R= 1.09 nm，表明整個體系發生了非輻射能量轉移。通過研究EB與HSA 之間的相互作用，可以了解EB 的毒性效應及毒性的分子機制，在臨床醫學及藥物學方面有較重要的意義。