豬皮中膠原蛋白的提取

林 琳，牛一帆，史振霞，尚校蘭，路彥霞，高瑞寒，王碧柔

（廊坊師范學院,河北 廊坊 065000）

0 引言

隨著生活水平的日益提高，人們對肉類的消費需求不斷上漲，尤其是豬肉。豬皮占胴體的10%，豬皮中含有大量蛋白質，是豬肉的2.5 倍之多，但是脂肪含量卻不足它的50%［1,2］。豬皮里面的主要成分是膠原蛋白，占蛋白質總含量的87.7%左右［3］。豬皮中的膠原蛋白可以使人的皮膚變得水潤柔滑、有彈性，可延緩衰老，預防癌癥和骨質疏松［4］。除此之外，有研究發現，膠原蛋白對預防近視也有一定的作用［5］。研究豬皮中膠原蛋白提取，可以充分發揮豬皮的營養價值，創造更大的經濟效益。目前，水解豬皮的方法主要包括酸法水解［6］、堿法水解［7］、氧化法水解［8］、酶法水解［9］以及混合法水解［10］。本研究采取酸法水解，操作簡單易行。

目前，國內報道多側重于研究豬皮中膠原蛋白的功能特性，而對于膠原蛋白的提取方法及提取率優化方面的研究鮮見報道。本研究通過正交試驗確定了豬皮中膠原蛋白提取的最佳條件，并對其純度進行測定，確定提取率最高的試驗條件，為膠原蛋白提取方法的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬皮（購于超市），對二甲氨基苯甲醛（分析純，天津市化學試劑一廠）；醋酸鈉（分析純，天津市化學試劑一廠）；異丙醇（分析純，天津市化學試劑一廠）；冰醋酸（分析純，天津市化學試劑三廠）；硫酸氫鈉（分析純，天津市化學試劑三廠）；羥脯氨酸標準品（北京索萊寶科技有限公司）；氯胺T（分析純，天津市光復試劑有限公司）；正丙醇（分析純，天津市光復試劑有限公司）；高氯酸（分析純，天津市光復試劑有限公司）

1.2 儀器與設備

電子天平（JA21002 型）：上海精密科學儀器有限公司；紫外可見光分光光度計（22PC0314 型）：上海棱光技術有限公司；冷凍干燥機（Christ ALPHA 1-2）：上海甄明科學儀器有限公司；pH 計（ST3100/F）：奧豪斯儀器常州有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-4型）：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 膠原蛋白提取

1.3.1 新鮮豬皮的處理

新鮮豬皮，刮去豬毛，去掉污物，60℃左右的熱水中洗滌3次，用刀去除皮下脂肪，將處理之后的豬皮切成1×1cm 的條狀，4℃保存。每份豬皮稱量5g，放入錐形瓶中待用。

1.3.2 樣品脫脂

脫脂液配制：配制2.5%，5.0%，7.5%，10%，12.5% 的脫脂液，分別稱取2.5g，5.0g，7.5g，10g，12.5g 的Na2CO3，蒸餾水溶解后，容量瓶定容至100mL。

脫脂時，每份樣品加入20mL 的蒸餾水，再加入以上5 種脫脂液，充分攪拌10min，過濾，按上述步驟再重復一次，清水漂洗兩次。每組實驗做三組平行。

1.3.3 鹽處理

鹽溶液配制：取2.25g NaCl，蒸餾水溶解，定容至250mL。

樣品鹽處理條件參照藍蔚青實驗方法［12］。

每份豬皮加8.3mL 等滲鹽水，放入恒溫水浴鍋內，在60℃的條件下分別水浴0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，期間不斷攪拌，使豬皮受熱均勻，用40℃的蒸餾水漂洗兩次。每組實驗做三組平行。

1.3.4 酸處理

樣品酸處理條件參照梁權實驗方法［13］。

36%醋酸溶液：36.18mL 冰醋酸，蒸餾水定容至100mL。

NaHSO3溶液：4g NaHSO3溶解于125mL 蒸餾水中。

用pH 計分別調配pH 為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 的醋酸緩沖液。

分別用以上5種不同pH值的醋酸緩沖液8.3mL對豬皮進行處理，放入60℃恒溫水浴鍋中水浴1.5h，期間不斷攪拌，使豬皮受熱均勻，用40℃蒸餾水漂洗兩次。每組實驗做三組平行。

1.3.5 凍干

將經過處理的豬皮放入冰箱預冷凍3-4h，放入冷凍干燥機-80℃冷凍干燥12 小時以上，取出。粉碎、稱重。

1.4 膠原蛋白純度測定（羥脯氨酸含量的測定）

1.4.1 試劑的配制

①檸檬酸緩沖液（pH6.8）：將14.0g 氫氧化鈉、26.0g檸檬酸和78.0g醋酸鈉溶解于500mL的蒸餾水中，轉移至1000mL 容量瓶，加入250mL 正丙醇，用蒸餾水定容，存于棕色瓶中，置于陰涼通風處。

②氯胺T 試劑：將1.41g 氯胺T 溶解于上述檸檬酸緩沖液。

③顯色劑：量取35.0mL 60%的高氯酸，加入10.0g 對二氨基苯甲醛，緩慢加入65.0mL 異丙醇（該試劑調配后立即用掉）。

④羥脯氨酸標準工作液（5μg/mL）：羥脯胺酸標準品5.0mg，蒸餾水定容至1000mL。

1.4.2 羥脯氨酸標準曲線的繪制

從豬皮中提取的膠原蛋白多為I型膠原蛋白，含大量的羥脯氨酸。本實驗通過測定羥脯氨酸含量，乘以系數（9.75）即可得到膠原蛋白的含量［14-15］。

配制濃度為0.5，1.0，1.5，2.0μg/mL 的標準溶液。分別取10.0、20.0、30.0與40.0mL的羥脯氨酸標準工作液于100mL的容量瓶中，蒸餾水定容。

準備具塞試管，取上述不同濃度的標準工作液4mL 于試管中，加入2mL 氯胺T 溶液，混勻，室溫靜置20min，加入2mL 對二氨基苯甲醛試劑，搖勻后立刻放入60℃的水浴鍋中，20min 后取出，冷水沖洗3min以上，放置在室溫下，30min后用紫外分光光度計測定吸光度，波長為558nm±2nm，繪制出標準曲線。以蒸餾水為空白對照。

1.4.3 羥脯氨酸含量測定

稱取4g膠原蛋白提取物放入錐形瓶中，用配制好的硫酸溶液在105℃的條件下對其進行水解，水解時間16h。用濾紙將水解液過濾至250mL 容量瓶中，蒸餾水定容。吸取4mL 標準工作液到試管中，根據測出的吸光度算出羥脯氨酸的濃度。按照公式（1）計算出樣品中的羥脯氨酸含量。

式中:W-提取物的羥脯氨酸含量，mg/g；C-標準曲線上對應的羥脯氨酸濃度，μg/mL；m-稱取樣品的質量，g；f-稀釋倍數。

1.5 正交試驗設計

以膠原蛋白得率為評價指標，根據單因素試驗結果，對脫脂液濃度、鹽析時間以及酸處理pH 進行三因素三水平正交試驗，通過正交試驗確定膠原蛋白最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 脫脂液濃度單因素試驗

脫脂液濃度單因素實驗結果如圖1所示。由圖1 可知，當脫脂液濃度為5.0%時，膠原蛋白提取物質量最大，為1.493g，故選取2.5%，5.0%，7.5%脫脂液濃度進行正交試驗。

圖1 脫脂液濃度對膠原蛋白提取物質量影響

2.1.2 鹽析時間單因素試驗

鹽析時間單因素試驗結果如圖2 所示。由圖2 可知，隨著鹽析時間的增加，膠原蛋白提取物質量隨之降低。當鹽析時間為0.5h，1.0h，1.5h 時，膠原蛋白提取物質量較大，分別為1.553g，1.440g，1.320g。但考慮鹽析時間過短，脂肪物質溶解不充分，故正交試驗中鹽析時間確定為1.0h，1.5h，2.0h。

圖2 鹽析時間對膠原蛋白提取物質量影響

2.1.3 酸處理pH單因素試驗

酸處理pH 試驗結果顯示，當pH 為4.0 時，膠原蛋白提取物質量最高，為1.33g，故選取pH3.5，4.0，4.5進行正交試驗。

2.1.4 正交試驗結果

正交試驗（L（933））因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

由極差分析可得，三個因素對膠原蛋白提取率的影響大小依次為鹽析時間＞pH＞脫脂液濃度，最終確定的優化條件是鹽析時間1.5h，pH 3.5，脫脂液濃度5%，此時，5g 豬皮膠原蛋白提取量為2.16g，得率為43.2%。

2.2 羥脯胺酸標準曲線的繪制

根據羥脯胺酸標準品濃度與吸光度繪制標準曲線，其線性回歸方程為：y=0.1728x+0.0026，其中x為羥脯氨酸濃度，y 為吸光度，相關系數R2=0.9992，表明相關性良好。標準曲線如圖3所示。

圖3 羥脯氨酸標準曲線

2.3 膠原蛋白提取物純度測定

按照1.4.3 中的方法測定最優提取條件下膠原蛋白提取物純度。當提取條件定為：鹽析時間1.5h，pH 3.5，脫脂液濃度5%，提取物吸光度為0.154，膠原蛋白純度為85.44%。

3 結論

本研究主要對豬皮中膠原蛋白提取條件進行優化。通過單因素試驗及正交試驗確定膠原蛋白最優的提取條件：鹽析時間1.5h，pH 3.5，脫脂液濃度5%；同時，利用分光光度計測定出該條件下膠原蛋白的純度為85.44%。本研究可為合理利用豬皮及工業化生產膠原蛋白提供理論依據。