柑橘果膠酯酶分離條件及生物學(xué)特性研究

王 晴，胡智慧，錢玉梅，李紅俠，陳紅玲，曹穩(wěn)根

（宿州學(xué)院，安徽 宿州 234000）

0 引言

果膠酯酶是一種能催化、水解果膠生成果膠酸和甲醇的酶，廣泛存在于植物中，常用于催化高甲氧基果膠脫去甲氧基，制備低甲氧基果膠以及用于果汁加工澄清中；果膠酯酶能夠提高食品粘度，延長貨架期，提高食品吸水性和穩(wěn)定性；果膠酯酶還有脫苦、去除異味和水果果皮等用途，因此果膠酯酶具有廣闊的開發(fā)前景［1-2］。柑橘皮和果肉中含有大量果膠酯酶［3-4］。本文以柑橘為原料，果膠酯酶活性為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化柑橘果膠酯酶的分離條件，并對(duì)其熱穩(wěn)定性及受金屬離子的影響進(jìn)行研究，為果膠酯酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘，產(chǎn)自湖南石門；果膠，鄭州華安食品添加劑有限公司；氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸亞鐵（FeSO4）、硫酸錳（MnSO2）、EDTA、氯化鉀（KCl）、氯化鋇（BaCl2）鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）等均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL20M 型高速冷凍離心機(jī)（廣東天元實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；HJ-3 型磁力攪拌器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；ZDDY-008 電位滴定儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柑橘果膠酯酶的提取及酶活測定

將柑橘剝皮、榨汁，按1:1 加入一定濃度的氯化鈉，在一定的溫度和pH 下提取一定時(shí)間，過濾，并在4 ℃下15000 r/min 離心30 min，取上清，即為柑橘果膠酯酶粗酶液，采用pH-strat 法測定柑橘果膠酯酶的酶活［5］。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在溫度為35℃，pH 為7，NaCl 濃度為2.4 mol/L時(shí)，提取柑橘果膠酯酶0、5、10、15、20、25、30 h；在溫度為35℃，pH 為7，NaCl 濃度分別為0、0.6、1.2、1.8、2.4、3 mol/L 時(shí)提取柑橘果膠酯酶20 h；在溫度為35℃，pH為4、5、6、7、8、9、10，NaCl濃度為2.4 mol/L，提取20 h；在提取溫度分別為10、15、20、25、30、35、40℃，pH 為7，NaCl 濃度為2.4 mol/L 時(shí)，提取20 h。測定各條件下酶活，探究各因素最佳水平。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以柑橘果膠酯酶酶活為指標(biāo)，選取溫度、pH、NaCl 濃度和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，L（934）正交表來進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化［6］，各因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

1.3.4 柑橘果膠酯酶生物學(xué)特性研究

1.3.4.1 柑橘果膠酯酶的熱穩(wěn)定性

將提取的果膠酯酶液分別放置在5、15、25、35、45、55 ℃條件下保存3 h 后，測其酶活。以最高酶活值為基準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)酶活［7-8］。

1.3.4.2 金屬離子對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

在酶液中分別添加2 mmol/L NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、BaCl2、MnSO4和EDTA 水溶液，常溫下保存30 min，測酶活。以最高酶活值為基準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)酶活［9-11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

由圖1 可看出，提取時(shí)間越長，酶活越高，提取時(shí)間超過20 h，酶活開始下降，由此可見，提取時(shí)間不宜過長，否則會(huì)造成酶液出現(xiàn)失活現(xiàn)象，因此，選擇最佳提取時(shí)間為20 h［12］。

圖1 提取時(shí)間對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

2.1.2 NaCl濃度對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

由圖2可見，隨NaCl濃度上升，提取液中的柑橘果膠酯酶的酶活基本呈線性關(guān)系上升，NaCl 濃度為2.4 mol/L時(shí)，酶活最大，而后酶活開始急劇下降。果膠酯酶屬于蛋白質(zhì)，低濃度的Na+能夠增加其溶解度，酶量增大，但Na+的濃度超過一定值之后，果膠酯酶就會(huì)鹽析沉淀，使得提取液中的酶量下降，酶活降低［3］。所以最佳NaCl濃度選為2.4 mol/L。

圖2 NaCl濃度對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

2.1.3 pH值對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

從圖3可知，pH小于6時(shí)，果膠酯酶的酶活隨著pH 的升高緩慢增加，pH 大于6 時(shí)果膠酯酶的酶活隨著pH 增大急劇上升，當(dāng)pH 為7 時(shí)酶活最大，pH超過7 時(shí)，酶活又開始下降。根據(jù)試驗(yàn)觀察，pH 大于7，溶液中有少量沉淀析出，可能此時(shí)接近其等電點(diǎn)，開始有少量蛋白酶析出，導(dǎo)致酶活下降。所以，提取果膠酯酶的最適pH值為7。

圖3 pH對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

由圖4 可以看出，在10～20 ℃時(shí)，果膠酯酶的酶活基本不變，20～35 ℃時(shí)，隨溫度的上升，提取液中柑橘果膠酯酶的酶活呈急劇增長的趨勢(shì)，當(dāng)超過35 ℃以后隨溫度上升呈下降趨勢(shì)，可見溫度對(duì)果膠酯酶的提取影響較大，原因可能與酶的最適作用溫度有關(guān)，低溫條件下，可能酶的活性較低，提取液中的酶活量較少，溫度過高反而會(huì)抑制酶活性。因此，最適提取溫度選用35 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可見，各因素主次順序?yàn)镃＞B＞D＞A，柑橘果膠酯酶提取的最優(yōu)條件組合為A3B3C2D3，即最佳的提取條件為pH 為7.5、提取時(shí)間為23 h、提取溫度38 ℃、NaCl濃度2.8 mol/L。按照最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測出酶活為（0.94±0.03）μmol/min·mL，說明了該方法可靠，因此可選為優(yōu)化柑橘果膠酯酶的最佳提取工藝條件。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 柑橘果膠酯酶的生物學(xué)特性

2.3.1 柑橘果膠酯酶熱穩(wěn)定性

從圖5 中可以看出，柑橘果膠酯酶的耐熱性較差，在不超過15℃時(shí)保存3 h 后相對(duì)穩(wěn)定，其相對(duì)酶活能夠保持在75%以上，高于15 ℃之后的相對(duì)酶活就逐漸下降，而在超過55 ℃時(shí)保溫3 h 以后柑橘果膠酯酶活性幾乎全部喪失。

圖5 柑橘果膠酯酶熱穩(wěn)定性

2.3.2 金屬離子對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

由圖6 可以看出，Ca2+、Na+、K+和Fe2+對(duì)果膠酯酶有明顯的促進(jìn)作用，其中Ca2+促進(jìn)效果最好；Ba2+、Mn2+和EDTA 對(duì)果膠酯酶卻有抑制作用，其中EDTA對(duì)果膠酯酶的抑制作用較大，酶活僅有20%。

圖6 金屬離子對(duì)柑橘果膠酯酶酶活的影響

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)，探究NaCl 濃度、pH、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)柑橘果膠酯酶活的影響，確定了最佳提取條件：NaCl 濃度為2.8 mol/L、pH 為7.5、提取溫度為38℃、提取時(shí)間為23 h時(shí)，此時(shí)柑橘果膠酯酶酶活最高，為（0.94±0.03）μmol/min·mL。該酶熱穩(wěn)定性較差，金屬離子Ca2+、Na+、K+和Fe2+對(duì)柑橘果膠酯酶具有激活作用，而Ba2+、Mn2+和EDTA對(duì)柑橘果膠酯酶起抑制作用。本研究可為柑橘果膠酯酶的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù)。