豬偽狂犬病病毒變異株在國內的研究進展

徐寧，欒美慧，郜艷雪，葛桂陽，李東麗，劉藝，宮慶龍，冷雪*，杜銳

(1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；3.教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室/吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，吉林 長春 130118)

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，該病作為自然疫源性疾病，可感染包括豬牛羊在內的40多種家畜、家禽、野生動物等，但是豬是唯一能夠在急性原發感染中存活并且表現出亞臨床癥狀和潛伏感染特性的宿主，不同年齡段的豬均可感染PRV并表現出不同的臨床癥狀：幼豬主要表現為神經癥狀，即嘔吐、搔癢、顫抖、癱瘓、腹瀉等，并可能死于嚴重的腦脊髓炎；懷孕的母豬感染PRV會導致胎兒流產或死亡[1]；成年豬則會出現發熱和呼吸道癥狀，且呈潛伏感染狀態，即耐過后長期帶毒排毒[2]繼而成為隱蔽傳染源，這一感染特性嚴重阻礙了偽狂犬病的防治及根除。

傳統的Bartha-k61株疫苗因具備良好的免疫效果而被廣泛使用，但是近年來PRV變異較為明顯，導致傳統疫苗的保護效果大幅度降低，自2011年開始，豬偽狂犬病再次在Bartha-k61株疫苗免疫過的豬場發生[3]，相比于傳統PRV毒株，PRV流行變異株致病力明顯增強，感染豬表現出更明顯的臨床癥狀和病理變化，發病率和死亡率也明顯增高，給我國的養豬業造成巨大的經濟損失。

1 PRV的特征

PRV屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，是一種具有泛嗜性、嗜神經性和潛伏感染等特性的病毒。

1.1 理化特征

PRV粒子在形狀上呈球形，未成熟的病毒粒子直徑約在120～150 nm之間，帶包膜的成熟的病毒粒子直徑約在150～180 nm之間。在結構上從內到外共分為4層，分別為雙鏈DNA病毒核心、二十面體核衣殼、包含蛋白質的皮層以及被囊膜蛋白包圍的外膜層[4]。因此PRV對有機溶劑乙醚、氯仿等極度敏感[5]，經5%苯酚處理2 min或接觸0.5%～1%氫氧化鈉就可使其迅速滅活；但PRV對熱耐受，完全滅活PRV需55～60 ℃持續30～50 min，80 ℃持續3 min，100 ℃持續1 min。

1.2 基因組特征

PRV是雙鏈線性DNA病毒，基因組全長約為143 kb，全基因組由4部分構成，分別為獨特長區段(UL)、短區段(US)、內部重復區段(IR)和末端重復序列(TR)[6-7]。目前對于UL區段的研究較為深入，PRV病毒的基因組通過滾環復制進行擴增，位于UL區段的某些基因以一定的方式調控病毒的復制，其中UL5、UL8、UL9、UL42與UL52等基因的轉錄翻譯產物均參與其復制過程[8]，除此之外，UL區段還分布著多個毒力基因，如gB(UL27)、gC(UL44)、gM(UL10)及TK(UL23)基因，這些基因與US區段的gD(UL6)、gI(US7)、gE(US8)基因共同決定病毒毒力。

2 PRV變異株流行情況

由于豬偽狂犬病具有潛伏感染，高致病性，高死亡率等特性，在很大程度上限制了我國豬場集約化養殖模式的發展，該病一直是研究熱點之一。多年來我國通過免疫接種，野毒監測及凈化等技術手段，已經使疫情得到有效控制。但是自2011年起，豬偽狂犬病再次在我國河北和山東等養殖密度較大的華北地區暴發流行，隨后疫情蔓延至我國中東部十余個省(市)，至2014年已蔓延至全國[9]，許多規?；呢i場都不同程度上出現了傳統疫苗免疫失敗的情況，具體表現為接種過傳統疫苗的豬群再次表現出疑似豬偽狂犬病的臨床癥狀，感染豬的發病率和死亡率呈明顯上升趨勢。經相關毒力基因測序表明新的PRV變異株抗原性已發生一定變異，分屬于一個相對獨立的分支，傳統的PRV毒株屬于基因Ⅰ型，而變異株屬于基因Ⅱ型。相比于經典強毒株，PRV變異株引起的臨床癥狀更明顯，傳播速度更快，致死率更高，呈現出毒力增強的趨勢[10]。

3 PRV變異株主要毒力基因及其遺傳變異

3.1 TK基因

TK基因位于UL區，長約963 bp，共編碼320個氨基酸。TK基因雖然是PRV體外復制的非必需基因[11]，但卻是PRV最主要的毒力決定因子，其編碼蛋白對PRV的毒力影響最大。因此TK基因常作為缺失致弱疫苗的主要靶基因[12]。同時，TK基因還以一定的方式調控PRV的潛伏感染及其在中樞神經系統中的增殖過程，在很大程度上決定病毒的長期感染性和嗜神經性。

由于存在保守序列，TK基因具有嚴格的保守性。黃藝珠等[13]從山東省某發病豬場分離鑒定得到PRV變異株并命名為SD株，將其 TK基因與國內外8個PRV毒株TK基因序列相比較，結果顯示SD株與匈牙利的 Bartha 株、Kaplan 株及韓國的 Yangsan 株相比核苷酸和氨基酸序列同源性分別為 99.4%～99.7%和99.7%，與國內其他毒株相比核苷酸和氨基酸同源性分別為99.1%～99.5%和97.6%～98.8%，與國外毒株同源性較高，說明SD 株可能是由國外毒株變異而來；王琳等[14]對河南省PRV變異株冀A株TK基因序列分析結果表明，冀 A 株 TK 基因與 GenBank 中收錄的國內外其他PRV毒株TK基因同源性都在99%以上，且都具有共同的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P *AR-，該結論與王勤等[15]報道的PRV TK、gD基因具有高度保守性的結果相吻合，與參考毒株相比，冀A株TK基因編碼的氨基酸存在丙氨酸(Ala)284→纈氨酸(Val)284變異，該突變為冀A株所特有。

3.2 gI基因

gI基因位于US區，長約1 050 bp，共編碼349個氨基酸，是PRV的重要毒力基因。gI基因編碼蛋白不僅可在細胞水平發揮其毒力作用，還可促進病毒在神經系統中的增殖，從而影響其神經嗜性。

肖少波等[16]研究發現單獨缺失gI或gC基因均可使PRV毒力下降，但雙缺失gI和gC基因的重組病毒毒力會大幅下降甚至完全喪失，由此得出結論gI基因可促進或協同其他毒力蛋白發揮毒力作用。研究表明在病毒侵染過程中，gI基因通過促進病毒在神經系統中的復制過程從而影響病毒的神經嗜性[17]。缺失gI基因的PRV雖然可以和野生型PRV一樣沿著神經元侵入到神經系統中，但相比于野毒來說，gI基因缺失株感染的神經元數量顯著降低。有報道稱gI基因編碼蛋白在172位缺失1個氨基酸及在238位插入1個氨基酸是PRV突變株的顯著特征，林群群等[18]對PRV變異株(NP株)gI基因進行同源性比對分析，結果顯示NP株與國外分離株(75V19株、NS374株、Becker株、Kaplan株)相比氨基酸同源性為89.9%～92.3%，與國內PRV分離株(BJ-YT株、Xiang A株、Ea株)相比氨基酸同源性為99.2%～99.5%，其中與國內PRV分離變異株相比氨基酸突變位點主要集中在第165～173位和第236～246位這2個區域，與報道中PRV突變株的顯著特征有出入，關于PRV變異株在gI基因上所體現出的突變規律還需更多的相關研究加以歸納總結。

3.3 gE基因

gE基因位于US區，前接gI基因，長約1 734 bp，共編碼577個氨基酸。gE基因編碼蛋白具有促進細胞融合的作用，在PRV入侵宿主細胞的過程中，gE糖蛋白通過促進感染細胞與非感染細胞的融合，從而介導病毒在細胞水平傳播而發揮其毒力作用。此外，gE糖蛋白還與PRV的組織趨向性密切相關，有助于病毒定向擴散至宿主中樞神經系統，在一定程度上決定PRV的嗜神經性[19]。在PR基因缺失疫苗研究中，gE基因常作為缺失致弱的標志基因，臨床上常采用gE-ELISA試劑盒檢測gE基因的有無從而區分PRV感染類型，即野毒株感染或疫苗株感染。

研究表明gE基因是與其他基因通過共價鍵形成統一體，以復合物的形式發揮其毒力作用的。Zuckermamna等[20]為了研究gE基因的致病機理，在感染的細胞中運用免疫沉淀法證實gE與gI不但形成gE/gI非共價復合物作為病毒的功能成分，而且可能以一個完整的功能性單位行使其功能，該復合物在促進病毒在細胞間擴散的同時，也涉及病毒從細胞的釋放及細胞融合過程[21]。此外gE/gI還可與其他基因進行互作而行使功能：gE/gI/TK相互作用會使PRV的毒力進一步增強；gE/gI/gC相互作用可主導病毒的釋放[22]。

gE基因在PRV基因組中相對保守，其本身遺傳變異性并不大。覃雨陽等[23]將國內外PRV毒株作為參考毒株，對廣西不同地區流行的4株PRV變異株gE基因進行同源性比對分析，研究結果顯示4株PRV變異株與廣東Fa株、湖北HD株等變異株相比氨基酸和核苷酸同源性分別高達99.8%和99.7%，遠遠高于與國內經典毒株的同源性，且與變異株廣東Fa株、湖北HD株相比，4株PRV變異毒株gE基因的48位均存在1個天冬氨酸插入的情況；趙鴻遠等[24]將在吉林和黑龍江發病豬場分離鑒定得到的2株PRV變異株分別命名為JL1株、HLJ1株，對2株變異株的gE基因進行同源性比對分析可知，與經典毒株相比JL1株、HLJ1株核苷酸同源性為96.6%～99.1%；與變異株相比核苷酸同源性為97.1%～99.5%，與變異株表現出較高的同源性，且變異株均存在gE蛋白48位和492位附近各插入1個天冬氨酸的情況，該研究認為此分子特征可用來鑒定PRV毒株變異與否，但是陳超等[25]調用GenBank中多株不同來源的PRV參考毒株與山東省12株PRV流行變異株的gE基因進行序列比對發現，LDZ04-2014株與2012年分離于國內的HBBA2012株的492位并沒有天冬氨酸的插入，而分離于2001年的Fa株、2008年的HNJZ等經典毒株的492位卻存在2個天冬氨酸的插入，所以gE基因492位天冬氨酸的插入現象并不是變異株所特有的分子特征，早在經典毒株中就存在，因此不能將其作為鑒定PRV毒株是否變異的標準，關于PRV變異株在gE基因上體現出的生物學特性尚需深入研究。

3.4 gB基因

gB基因位于UL區，全長約2 742 bp，共編碼913個氨基酸，是PRV的主要毒力基因。gB基因編碼蛋白作為PRV病毒粒子的主要結構蛋白，不僅是病毒囊膜的主要成分，還可以誘導機體產生2種中和抗體從而發生特異性細胞免疫和體液免疫反應，此外糖蛋白gB也與PRV感染宿主密切相關，在PRV入侵宿主細胞過程中，首先糖蛋白gC介導PRV病毒粒子結合到宿主細胞表面[26]，調控有糖蛋白gB參與的PRV膜早期融合過程，gD受體結合蛋白再與宿主表面的受體蛋白結合，激發gB和gH/gL二聚體這一核心融合機器發揮作用，使PRV病毒粒子與宿主細胞融合從而完成侵染過程。

gB基因是皰疹病毒屬中最保守的糖蛋白基因，在PRV的遺傳變異過程中表現出高度保守性。張新平等[27]以GenBank中收錄的國內外具有代表性的PRV分離株作為參考毒株，對福建變異株(LY株)gB基因進行同源性比對分析，結果顯示LY株與國外參考毒株(Becker株、Bartha株、Kaplan株、SouthKorea株、Japan株)相比氨基酸及核苷酸同源性分別為62.9%～96.4%、74.9%～98.1%；與國內流行毒株Ea株(湖北)相比氨基酸及核苷酸同源性分別為95.8%、98.8%，與國內流行毒株表現出較高的同源性，表明LY株是由國內流行株遺傳變異而來；劉志成等[28]通過對廣東省2015年分離得到的PRV流行變異株(LC株)gB基因進行分析比對可知，LC株與中國經典毒株(Ea株、Fa株、SC株)相比氨基酸及核苷酸同源性分別為99.1%～99.3%、99.7%～99.8%；與2012年分離變異株(HNX株、HNB株、HN1201株、HeN1株、JS-2012株、ZJ01株、TJ株、HLJ8株)相比同源性分別為99.8%～99.9%、99.9%～100.0%，證明LC株是在PRV變異株的基礎上發展而來的。

4 PRV變異株疫苗的研制

疫苗在防控PRV流行的過程中發揮了重要作用。目前國內市場上現有的以經典PR毒株為親本的基因缺失疫苗主要包括Bartha-K61株、鄂A株、Hb98株、Hb2000株SA215株等，其中以Bartha-K61株為重要代表，Bartha-K61疫苗株缺失了主要毒力基因gE，為gE基因缺失疫苗結合gE-ELISA鑒別診斷方法凈化和根除PR提供理論基礎。這些疫苗對我國PR的防控發揮了巨大的作用。但是自2011年以后，我國部分地區的豬場免疫過Bartha-K61疫苗的仔豬相繼表現出疑似PR的臨床癥狀，新的PR引發的疫情再次暴發流行，并從華北地區開始蔓延至全國，且臨床采樣結果顯示PRV野毒檢出率增加。楊濤等[29]將廈門市2017年分離得到的PRV變異株與4個廠家的Bartha-K61活疫苗的免疫原性基因gB、gC、gD進行同源性比對分析，結果顯示變異株與Bartha-K61疫苗株相比，在gB、gC、gD蛋白序列中均存在不同程度的差異，在其氨基酸序列基礎上建立的進化分析結果表明，PRV變異株與Bartha-K61分屬于不同進化分支，從而導致Bartha-K61的免疫保護效力不足以抵抗PRV變異株的攻擊。據報道，Bartha-K61對于PRV新流行變異株引起的疫情免疫失敗的情況在我國多有發生，新的PR疫情表現為高致病力，高死亡率，流行勢頭迅猛，因此研制新的針對PR流行變異株的疫苗刻不容緩。

目前，針對PRV流行變異株基因缺失疫苗開展了大量研究。童武等[30]運用同源重組的方法構建了gE/gI雙基因缺失的JS-2012株，利用該毒株的滅活疫苗接種1次后免疫仔豬對變異毒株JS-2012的保護率達到60%，免疫2次后保護率達到100%；顧真慶等[9]利用同源重組技術構建了雙基因缺失株vZJ01ΔgE/gI，將該毒株制成滅活疫苗，與Bartha-K61對照組共同進行豬體免疫保護試驗，結果表明vZJ01ΔgE/gI滅活疫苗可以抵御PRV超強毒株ZJ01株的致死攻擊，且免疫效果優于對照組Bartha-K61活疫苗。

基于雙基因缺失的三基因缺失苗具有更好的安全性及免疫原性，基本不會有散毒或毒力返強的情況出現。Cong等[31]利用細菌人工染色體技術構建了gE/gI/TK三基因缺失的HN1201株，對豬群持續免疫4周后進行攻毒試驗，結果顯示該缺失株對免疫豬群的保護率高達100%；胡睿鳴等[32]運用基因工程技術構建了gE/gI/TK三基因缺失的 r SMXΔgI/gEΔTK株，該毒株接種1次后免疫仔豬對變異毒株CH/HNSMX/2012的保護率就可達到100%，且易感動物(小鼠、綿羊、新生仔豬等)經免疫后并未表現出臨床癥狀，表明該毒株安全性良好。呂素芳等[33]在TK基因缺失的質粒pBTK及gI/gE雙基因缺失株PRV SA738病毒基因組的基礎上，運用脂質體介導法構建了三基因缺失株gI/gE/TK PRV SA738，利用該毒株制成活疫苗首免仔豬42 d后進行攻毒試驗，結果表明該三基因缺失株對SA等強毒株的攻擊可提供完全免疫保護，且免疫效果優于gE/gI PRV突變株。

諸多臨床實踐證明基因缺失苗可使免疫豬免受PRV變異株的致死性攻擊，可作為有效的候選疫苗，且與傳統毒株疫苗相比基因缺失苗具有致病性小，無潛伏感染，安全高效等優勢，在對PR的防控方面具有重要意義。截止目前，由我國國家獸用藥品工程技術研究中心研制的豬偽狂犬病滅活疫苗(HN1201-ΔgE株)已于2019年1月取得新獸藥注冊證書。該疫苗株是在PR變異株(HN1201株)作為母本的基礎上缺失gE基因而得到的，對當前PRV流行變異株引發的豬偽狂犬病具有較好的免疫保護效果，且可通過gE-ELISA診斷試劑盒鑒定PR感染類型。

5 PRV感染的防控

PRV多為潛伏感染，即接種疫苗后的康復畜群雖恢復正常生產，但應激后仍會重新激發隱性感染而表現出臨床癥狀，并長期帶毒散毒而成為二次感染源，這一特點使該病在豬群中長期循環傳播，嚴重阻礙我國養豬業的發展進程，因此開展豬偽狂犬病防控措施的研究有重要意義。

對于PRV的防控主要應從免疫接種，加強飼養管理和消除傳播媒介等幾個方面著手。首先要基于豬場具體的檢疫情況制定合理的免疫程序，通常以豬場陽性率10%作為臨界水平，陽性率高于10%時一般采取密集免疫形式，低于10%時采取一般免疫形式，同時定期對豬群PR陽性率進行監測，并根據監測結果及時調整免疫程序，根據毒株流行情況指導疫苗選擇，對于疑似隱性帶毒豬要制定合理的免疫方案并嚴格按照免疫程序執行，同時利用間接ELISA法檢測豬群抗體水平，掌握豬群潛伏感染情況，對于陽性豬，隱性帶毒豬一律采取淘汰，撲殺的處理方式，從源頭上阻斷PRV的感染和傳播。同時加強飼養管理，基于飼養標準針對豬群制定科學合理的飼養方案，滿足機體的營養需求，同時營造干凈衛生的飼養環境，對豬舍進行定期消毒以預防病原傳播及疫情擴散蔓延，消毒時以2種以上消毒藥物交替使用為宜。消除傳播媒介對于PRV感染的防控同樣重要，規模化養豬場要構建一套適用于豬場自身條件的生物安全體系，根據豬種類的不同實行分群飼養，對進入豬場的車輛和人員進行嚴格消毒。另外鼠類作為PRV的主要帶毒者和傳播媒介應給予高度重視[34]。在做好定期滅鼠工作的同時也要注意飼料保存，避免用于投喂的飼料被鼠代謝物污染。

6 小結

近年來由于PRV在基因組水平上發生了新的變異，導致其相比于傳統毒株在抗原性以及毒力方面發生較大變化，因此傳統疫苗已經不能使豬群完全抵御PR的攻擊，研制一種針對當前PRV流行株的新型疫苗就顯得極為迫切和必要。

PRV毒力由多基因共同調控，致病機理復雜，目前基因缺失疫苗憑借其顯著的優勢在控制PR方面表現出了良好的發展前景。因此，今后PR疫苗發展的主要方向還是構建新的基因缺失株從而發展雙價或多價疫苗，但致弱PRV在作為構建基因缺失苗技術核心的同時，也引起了一些問題，例如會在一定程度上導致疫苗的保護效果降低等，所以基因缺失疫苗的安全性及免疫效力還需進一步的評價。針對于PRV變異株的疫苗HN1201-ΔgE株疫苗已于2019年獲得新獸藥證書，相信隨著基因缺失手段的成熟及PR防控體系的健全，更多的基因缺失疫苗在不久的將來會應用于臨床，為偽狂犬病的區域性凈化及全國凈化奠定堅實的基礎。