禽白血病病毒gp37基因生物信息學分析及克隆表達

張雪，曹利利，郭衍冰，董航，苑淑賢，姚新華，趙權

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.吉林省畜牧獸醫科學研究院，吉林 長春 130062)

禽白血病(avian leucosis)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(avian sarcoma virus，ASV)引起的以禽類造血組織中某些細胞增生為主的腫瘤性傳染病的統稱[1]。該病主要通過先天感染和水平接觸感染傳播[2]。感染此病的雞群或者野生禽類會出現發育不良、抵抗力下降、身體各部位生出腫瘤等癥狀，此病對于全球養禽業具有一定威脅[3]。該病主要宿主是雞，在肉雞、蛋雞及我國地方品系雞群中均有發生，死亡率一般為1%～2%，高發時可達20%。我國已經把禽白血病歸類為二類動物疫病[4]。

ALV是直徑約90 nm的C型逆轉錄RNA病毒。根據gp85蛋白抗原性的差異以及病毒中和、受體結合和交叉干擾等試驗，將ALV分為A、B、C、D、E和J等10個亞群。ALV結構基因編碼區從5′端到3′的順序為gag-pol-env。其中env基因編碼病毒的2個囊膜蛋白，gp85表面蛋白和gp37跨膜蛋白[5]。gp85編碼ALV受體結合決定簇，通過與宿主細胞表面受體結合，使gp37構象發生改變，通過gp37編碼的跨膜蛋白定位到細胞膜上最終使病毒與宿主的細胞膜融合[6]。由于gp85的中心區包含5個可變區簇，導致其極易發生突變[7]。因此，gp37中含有的相對保守序列很可能成為抗病毒的重要靶點，而目前我國對該基因的研究很少。為深入了解gp37結構和功能，本研究借助生物信息學的方法對gp37蛋白質的理化性質等進行分析，通過構建重組質粒，誘導gp37的原核表達并純化其蛋白，為后續制備相應單抗、建立禽白血病診斷方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

大腸桿菌DH5α感受態、BL21(DE3)感受態，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD18-T質粒、pET-28a(+)載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ均購自寶生物工程(大連)有限公司；2×TaqPCR MasterMIX，DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒(離心柱型)均購自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)購自康為世紀；脫脂奶粉購自OXOID，HRP標記兔抗雞二抗購自EARTHOX，DAB顯色試劑盒購自邁新試劑。

1.3 引物的設計合成及gp37基因擴增

依據ALV-J HPRS-103株的gp37基因序列(GenBank：Z46390)設計合成了1對特異性引物。上游引物(gp37-F)：5′-AAAGAGG-ATCCATGTCGCTGAGTCGTCTCTCGCC-3′(斜體為BamHⅠ酶切位點)，下游引物(gp37-R)：5′-GCGCAAGCTT-TTACAGCTGCTCCCTAATTCTATG-3′(斜體為HindⅢ酶切位點)，目的片段大小為591 bp。以ALV JL-2株(本實驗室分離)前病毒cDNA為模板，PCR 擴增gp37基因。具體反應體系：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，gp37-F 1 μL，gp37-R 1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。

1.4 重組表達質粒的構建及鑒定

將回收的PCR產物取5 μL與0.5 μL pMD18-T 質粒、4.5 μL酶溶液Ⅰ置于1.5 mL離心管中連接，4 ℃過夜。轉化至DH5α感受態，構建克隆載體pMD-gp37。應用質粒小提試劑盒(離心柱型)提取質粒，經gp37-F/gp37-R為引物及限制性內切酶BamHⅠ/HindⅢ分別進行PCR及雙酶切鑒定并測序。將測序正確的pMD-gp37及pET-28a(+)用BamHⅠ/HindⅢ進行雙酶切，T4 DNA連接酶連接酶切后的目的片段及載體，轉化感受態細胞BL21(DE3)中，構建重組表達載體pET-gp37。提取質粒后進行PCR 鑒定和酶切鑒定。

1.5 序列分析

選取13株不同分型禽白血病病毒毒株gp37基因(表1)，通過DNAman軟件，經BLAST進行進化分析。將測序結果通過生物信息學軟件對該序列的編碼蛋白質的理化性質、信號肽，親/疏水性等進行分析。

表1 13株不同分型禽白血病病毒毒株信息

1.6 目的基因的誘導表達及鑒定

1.6.1 SDS-PAGE鑒定

分別接種10 μL鑒定為陽性的pET-gp37重組菌及pET-28a(+)對照菌至5 mL含有Kan(30 μg/mL)抗性的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜。再按照1∶100分別接種至新的100 mL含有 Kan(30 μg/mL)抗性的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養1.5～2 h，至OD600達到0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃振蕩培養4 h。分別吸出1 mL置于1.5 mL離心管12 000 r/min離心1 min，棄上清。加入40 μL蒸餾水及10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑混勻。沸水中浴10 min，12 000 r/min離心5 min，進行SDS-PAGE鑒定。另吸出4 mL重組菌，8 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入1 mL PBS混勻，冰浴超聲破碎菌體，分離沉淀和上清。取40 μL上清加10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑，混勻；取40 μL蒸餾水及10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑加入沉淀，混勻。將上述2管樣品沸水浴中煮10 min，12 000 r/min離心5 min，進行SDS-PAGE鑒定其表達形式。

1.6.2 Western blot鑒定

將誘導表達后pET-gp37重組菌及pET-28a(+)對照菌進行SDS-PAGE鑒定。通過轉膜儀將凝膠中蛋白質轉至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉的緩沖液中封閉。以J型ALV陽性雞血清為一抗，HRP標記兔抗雞為二抗進行孵育。最后應用DAB顯色試劑進行顯色。

1.7 表達產物的純化及鑒定

將誘導表達的pET-gp37重組菌，8 000 r/min離心5 min，棄上清，加入10 mL結合緩沖液, 冰浴超聲波裂解菌體。12 000 r/min離心10 min，收集上清。應用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)純化后進行SDS-PAGE鑒定。

2 結果與分析

2.1 gp37基因的擴增與克隆載體鑒定

將PCR擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約591 bp處有1條清晰的條帶，與預期目的條帶大小一致，如圖1。將獲得的gp37目的基因連接至pMD-18-T載體，構建成克隆載體質粒pMD-gp37，通過PCR及雙酶切鑒定，結果如圖2 所示，在約591 bp處均有目的片段條帶。

M.DL2000 DNA Marker；1.目的片段

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR鑒定；2.雙酶切；3.pMD-gp37質粒對照

2.2 序列分析

2.2.1 同源性分析

測序結果顯示，ALV JL-2株gp37基因含有591個核苷酸，編碼197個氨基酸。與HPRS-103株通過BLAST進行比對表明，核苷酸序列同源性為98.82%，氨基酸序列同源性為96.95%，二者位于同一進化分支(圖3)。

?本試驗研究毒株

2.2.2 gp37蛋白理化性質分析

應用Prot Param 在線軟件對gp37基因理化性質分析。該蛋白含有197個氨基酸，酸性氨基酸(Asp+Glu)22個，堿性氨基酸(Arg+Lys)20個，分子量22 kDa，等電點pI 6.36，分子式是C989H1572N276O278S14，原子總數3129。在280 nm處，所有半胱氨酸形成二硫鍵時，消光系數是23 990 mol/cm(Abs=1 g/L，1.079)，所有二硫鍵均打開時，消光系數是23 490 mol/cm(Abs=1 g/L，1.057)。肽段N末端是 S(Ser)時，估計在哺乳動物網織紅細胞體外半衰期1.9 h，在酵母體內半衰期>20 h，在大腸桿菌體內半衰期>10 h。不穩定指數43.10，表明該蛋白在溶液中不穩定。脂溶性指數104.06，平均親水指數0.142。

2.2.3 gp37蛋白信號肽分析

利用SignalP-5.0 對gp37蛋白信號肽進行分析，結果顯示信號肽值是0.015 5，表明無信號肽。

2.2.4 親/疏水性分析

利用ProtScale對gp37蛋白親/疏水性分析，其中正值表示疏水性，值越大疏水性越大，負值表示親水性，值越小親水性越強。1.0～3.0表示高疏水性氨基酸，-3.0～-1.0表示高親水性氨基酸。結果如圖4所示，gp37蛋白有較多個疏水性氨基酸，親/疏水性最小值是-2.067，最大值是3.489。

圖4 親/疏水性分析結果

2.3 重組表達質粒的PCR及雙酶切鑒定

將構建的原核表達pET-gp37陽性質粒進行PCR及雙酶切鑒定，在591 bp左右出現1條特異性條帶，與預期目的片段大小相符，如圖5。

M.DL2000 DNA Marker；1.pET-28a對照；2.雙酶切鑒定結果；3.PCR鑒定結果

2.4 誘導表達產物及純化蛋白的SDS-PAGE、Western blot鑒定

將重組表達菌pET-gp37經IPTG誘導表達處理后作SDS-PAGE及Western blot鑒定，均出現與目的蛋白22 kDa大小相符的條帶。蛋白純化后經IMAGE J灰度分析，純度為98%，純化的gp37蛋白濃度是2.7 mg/mL，如圖6、圖7。

M.預染蛋白質Marker Ⅲ；1.pET-28a(+)誘導表達產物；2.pET-gp37誘導表達產物；3.純化產物

3 討論

相對于gp85而言，gp37具有相對保守的基因序列，且其在細胞病毒融合過程中起關鍵作用，因此gp37可作為防治禽白血病相關研發的另一重要蛋白[8-9]。國內關于gp37蛋白鮮有報道，僅王曉偉等[10]利用昆蟲桿狀病毒表達系統對該基因進行了表達。本試驗利用原核表達系統對gp37基因進行表達，并采用生物信息學方法對gp37基因編碼產物進行分析，為揭示gp37基因的特性提供了有價值的理論依據。

以往有研究表明，蛋白質的半衰期與其穩定性相關，即半衰期長則穩定性高[11]。本研究結果顯示，gp37半衰期不長，屬于不穩定蛋白，且含有多個疏水性氨基酸,無信號肽屬非分泌蛋白，而這些特性與其功能的發揮是否存在某種聯系，值得后續研究。

大腸桿菌表達系統是目前重組蛋白表達與純化最常用系統，擁有眾多不同類型的載體，與其他表達系統相比具有遺傳背景清晰、生長迅速、培養成本低、表達量高等諸多優點，至今已發展成為一種安全的基因工程實驗體系，廣泛應用于疫苗生產和蛋白質功能等方面的研究[12]。本研究對gp37基因進行原核表達，得到帶有His標簽的融合蛋白，為進一步分析gp37結構和功能，制備gp37蛋白的抗體，建立新的ALV檢測方法等后續研究提供了參考。