山羊痘病毒G9和A16基因的克隆及生物信息學分析

趙宏吉，張金花，司朵朵，張珠明，李繼東

(寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021)

山羊痘是由山羊痘病毒(goatpox virus, GTPV)引起山羊的一種高度接觸性傳染病，發病率高，同群感染的山羊發病率可達100%[1]。主要通過空氣飛沫傳染和接觸傳染等方式傳播，發熱、呼吸道癥狀及在皮膚黏膜出現痘疹為該病的特征，在中國被列為一類動物疫病[2]。山羊痘可導致山羊的體重減輕，懷孕母羊的流產率上升[3]，還會對皮毛造成損壞[4]，這給養羊業造成了巨大的經濟損失，而且還有山羊痘感染人的相關報道[5]，說明研究該病具有公共衛生學意義。世界上很多國家有山羊痘的相關報道，該病在希臘、越南、蒙古等出現過暴發流行[6]。國內多呈地方性流行，如云南、寧夏、湖南、山東、黑龍江、內蒙古、甘肅、青海、江蘇等地也有山羊痘的發生[7]。

GTPV屬于痘病毒科山羊痘病毒屬，是一種有囊膜包被的DNA病毒。GTPV基因組呈雙股線形，約有150 kb，(A+T)含量約為75%。病毒大小約為300 nm×270 nm×200 nm，可在羔羊睪丸和羊腎的單層細胞、雞胚絨毛尿囊膜上良好地生長[8]。GTPV的基因組中約有147個開放閱讀框(ORF)，病毒基因編碼的部分蛋白是重要的結構蛋白[9]。當前，人們對痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)的基因組以及編碼的功能蛋白已經有了較為系統、深入的研究。有研究顯示，在VACV中，有12種蛋白參與病毒對細胞的侵入和融合[10]。而在侵入和融合作用的蛋白中，A16和G9是較早被鑒定為與侵入、融合相關的病毒膜蛋白，該蛋白是可溶性的肉豆蔻酰化蛋白，在病毒復制組裝或有感染性的病毒顆粒產生過程中起到重要作用[11]。有試驗證明，當VACV缺失了G9、A16基因就不能進行復制，說明G9、A16基因參與病毒的復制[12]；在不誘導G9、A16表達蛋白時，病毒只能停留在宿主細胞表面，無法進入細胞內，說明這2個蛋白與病毒侵襲宿主細胞的毒力有關[13]。各種痘病毒在基因組成、排列方式以及核苷酸序列等方面具有不同程度的保守性，保守性較高的基因在病毒復制、組裝以及感染宿主細胞等過程中起著重要作用[14]。借鑒和參考VACV感染宿主細胞相關膜蛋白的研究成果，通過比對分析GTPV和VACV的基因組，發現VACV的部分基因在GTPV基因組中具有對應的同源基因[15]。由此推斷，GTPV 中G9、A16的同源基因在病毒的復制與感染中具有與VACV G9、A16基因相似的作用。

本研究通過NCBI數據庫查找VACV G9、A16基因在GTPV中的同源基因序列gp055、gp103，克隆編碼GTPV疫苗株G9、A16蛋白的基因序列，利用生物信息學方法分析G9、A16蛋白的性質與功能，為進一步開展相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株

本試驗所用山羊痘病毒疫苗株GTPV AV41來源于中國獸醫藥品監察所，由本實驗室保存。

1.2 試劑

2×TaqPlus Master Mix，購自紐英侖生物技術(北京)有限公司；凝膠回收試劑盒，購自上海百賽生物技術股份有限公司。

1.3 引物設計和合成

參考山羊痘病毒Goatpox Virus Pellor(登錄號：NC_004003)的基因組序列設計引物，從山羊痘病毒弱毒疫苗GTPV AV41的基因組中擴增編碼G9蛋白和A16蛋白的基因序列，大小分別為1 011和1 134 bp，使用Primer Premier 5.0軟件設計2對特異性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為：GTPV G9-F：5′-ATGGGTTCTTCTTTTACAGTTC-3′；GTPV G9-R：5′-TTAAATAGCTACAATTAATACCCAT-3′；GTPVA16-F：5′-ATGGGTGGATCTGTATCTGTAAC-3′；GTPV A16-R：5′-TTATCGTCTACGAACATTTATATTATT-3′。

1.4 基因擴增和鑒定

以提取的山羊痘病毒疫苗毒株GTPV AV41基因組為模板，使用引物GTPV G9-F、GTPV G9-R、GTPV A16-F、GTPV A16-R進行PCR擴增。

PCR反應體系為：50 μL，2×TaqPlus Master Mix 25 μL、模板3 μL、上下引物各2 μL、ddH2O 18 μL。

PCR反應為：95 ℃ 預變性5 min；98 ℃ 變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸80 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定并切膠回收目的片段，將回收的目的片段放入4 ℃冰箱保存并送公司進行測序。

1.5 序列比對及進化樹構建

從NCBI數據庫中截取痘病毒科不同屬中常見的痘病毒G9、A16的同源基因序列進行比對(表1)，使用DNAStar的MegAlign軟件進行核苷酸序列一致性比對分析，并用MEGA軟件構建分子進化樹。

表1 基因序列

1.6 生物信息學分析

將GTPV AV41 G9、A16基因核苷酸序列利用DNAStar的EditSeq軟件翻譯成蛋白序列，通過在線工具ExPASy(http://www.expasy.org/tools/#proteome)預測蛋白質的理化性質；通過SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白質的二級結構；通過MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)預測蛋白質的保守結構域；通過ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)對蛋白質疏水性進行分析；通過NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白質的磷酸化位點；通過TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白質的跨膜區；通過EMBOSS Needle(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)比對蛋白序列差異；通過DNAStar的Protean軟件預測蛋白質的抗原表位；通過Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析蛋白質的三級結構。

2 結果與分析

2.1 A16、G9基因擴增

PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳鑒定，有2處明亮且單一的目的條帶(圖1)，與預期片段1 134 bp(A16)和1 011 bp(G9)大小相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.A16基因；2.G9基因

2.2 G9、A16基因序列比對

使用DNAStar的MegAlign軟件對GTPV AV41的G9、A16基因測序結果與其他毒株的相應序列進行核苷酸序列一致性比對分析，GTPV AV41與GTPV Pellor的G9基因一致性為99.4%，與SHPV 17077-99、LSDV NI-2490的G9基因一致性為96.3%和97.1%，與VACV IHD-J的G9基因一致性為56.8%(圖2A)。GTPV AV41與GTPV Pellor的A16基因一致性為99.4%，與SHPV 17077-99、LSDV NI-2490的A16基因一致性為97.5%和98.4%，與VACV IHD-J的A16基因一致性為63.8%(圖2B)。

圖2 G9(A)、A16(B)基因的一致性比較

2.3 進化樹的構建

使用MEGA軟件Neighbor Joining方法將所篩選的不同物種的蛋白序列構建進化樹，結果顯示GTPV AV41與GTPV Pellor的親緣關系最近，與SHPV 17077-99次之，與VACV IHD-J的親緣關系較遠，GTPV AV41與VACV IHD-J分別在2個不同的大分支上(圖3)。

圖3 G9(A)、A16(B)蛋白序列進化樹

2.4 蛋白質的理化性質

通過在線工具ExPASy對GTPV AV41的G9、A16蛋白理化性質進行預測，發現G9蛋白由336個氨基酸組成，相對分子質量為39 021.61，理論等電點為7.39，不穩定系數為38.52。A16蛋白由377個氨基酸組成，相對分子質量為43 976.80，理論等電點為9.09，不穩定系數為44.60。

2.5 磷酸化位點分析

通過NetPhos 3.1 Server預測G9、A16蛋白的磷酸化位點。結果顯示，GTPV AV41的G9蛋白共有34個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點有23個，位于288位的氨基酸置信度最高，為0.997；酪氨酸(Tyr)磷酸化位點有6個，位于46位的氨基酸置信度最高，為0.823；蘇氨酸(Thr)磷酸化位點有5個，位于256位的氨基酸置信度最高，為0.847(圖4A)。在VACV IHD-J的G9蛋白中共有29個磷酸化位點，其中Ser 磷酸化位點有15個，位于105位的氨基酸置信度最高，為0.988；Tyr磷酸化位點有5個，位于108位的氨基酸置信度最高，為0.965；Thr磷酸化位點有9個，位于124位的氨基酸置信度最高，為0.912(圖4B)。

GTPV AV41的A16蛋白共有36個磷酸化位點，其中Ser 磷酸化位點有18個，位于118位的氨基酸置信度最高，為0.993；Tyr磷酸化位點有9個，位于110位的氨基酸置信度最高，為0.953；Thr磷酸化位點有9個，位于191位的氨基酸置信度最高，為0.875(圖4C)。在VACV IHD-J的A16蛋白中共有41個磷酸化位點，其中Ser 磷酸化位點有15個，位于198位的氨基酸置信度最高，為0.990；Tyr磷酸化位點有11個，位于44位的氨基酸置信度最高，為0.970；Thr磷酸化位點有15個，位于6位的氨基酸置信度最高，為0.871(圖4D)。

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

2.6 抗原表位預測

通過DNAStar的Protean軟件預測GTPV AV41和VACV IHD-J G9、A16蛋白的抗原表位。GTPV AV41 G9蛋白可能的抗原表位有17個，預測結果為：第9～28、30～33、40～44、50～59、68～93、100～133、138～150、157～168、175～180、191～199、208～215、221～234、236～252、256～263、266～272、279～306、312～316位氨基酸(圖5A)；VACV IHD-J G9蛋白可能的抗原表位16個，預測結果為：第7～23、27～32、47～65、79～89、95～110、116～130、134～144、151～165、175～184、195～205、211～221、223～252、272～277、278～287、292～301、302～309位氨基酸(圖5B)。

GTPVAV41 A16可能的抗原表位有19個，預測結果為：第12～21、30～33、41～55、62～66、70～81、85～99、103～125、126～146、150～171、176～184、189～196、204～214、236～244、250～253、257～264、269～294、306～342、362～371、373～377位氨基酸(圖5C)；VACV IHD-J A16蛋白可能的抗原表位21個，預測結果為：第7～12、13～24、29～35、36～44、49～60、86～99、104～119、128～144、145～158、160～171、174～187、189～196、203～212、220～224、236～245、250～263、270～280、282～293、305～322、325～338、361～377位氨基酸(圖5D)。

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

2.7 二級結構

通過在線工具SOPMAy對GTPV AV41和VACV IHD-J的G9、A16蛋白二級結構進行預測。結果顯示，在GTPV AV41的G9蛋白中α-螺旋(h)由123個氨基酸組成，占36.61%；β-折疊(e)由50個氨基酸組成占14.88%，β-轉角(t)由19個氨基酸組成占5.65%，無規則卷曲(c)由144個氨基酸組成，占42.86%。在VACV IHD-J的G9蛋白中α-螺旋(h)由134個氨基酸組成，占39.41%；β-折疊(e)由50個氨基酸組成占14.71%，β-轉角(t)由17個氨基酸組成占5.00%，無規則卷曲(c)由139個氨基酸組成，占40.88%。

在GTPV AV41的A16蛋白中α-螺旋(h)由96個氨基酸組成，占25.46%；β-折疊(e)由80個氨基酸組成占21.22%，β-轉角(t)由19個氨基酸組成占5.04%，無規則卷曲(c)由182個氨基酸組成，占48.28%。在VACV IHD-J的A16蛋白中α-螺旋(h)由101個氨基酸組成，占26.79%；β-折疊(e)由87個氨基酸組成占23.08%，β-轉角(t)由23個氨基酸組成占6.10%，無規則卷曲(c)由166個氨基酸組成，占44.03%。

2.8 保守結構域分析

使用MEME在線工具(域寬度=6～50)預測比對GTPV AV41和VACV IHD-J以及其他幾種痘病毒的G9、A16蛋白保守結構域，結果顯示，在GTPV AV41的G9蛋白序列中，有9個結構域，最大的結構域長度為50個氨基酸殘基，最小的為6個氨基酸殘基，VACV IHD-J的G9蛋白有10個結構域(圖6)。在GTPV AV41的A16蛋白序列中，有10個結構域，最大的結構域長度為50個氨基酸殘基，最小的為8個氨基酸殘基, VACV IHD-J的A16蛋白有10個結構域(圖7)。

1.VACV IHD-J；2.GTPV Pellor；3.SHPV 17077-99；4.LSDV NI-2490；5.FWPV strain NVSL；6.CMPV M-96；7.MPV Zaire-96-I-16；8.VARV major；9.SWPV KASZA；10.GTPV AV41

1.VACV IHD-J；2.GTPV Pellor；3.SHPV 17077-99；4.LSDV NI-2490；5.FWPV strain NVSL；6.CMPV M-96；7.MPV Zaire-96-I-16；8.VARV major；9.SWPV KASZA；10.GTPV AV41

2.9 疏水性分析與跨膜區預測

分別使用ProtScale和TMHMM Server v.2.0網站對GTPV AV41和VACV IHD-J的G9、A16蛋白疏水性和跨膜區進行分析。由分析結果可知，在GTPV AV41的G9蛋白中，第330位色氨酸(Trp)最高，為3.456，疏水性最強；第84位天冬酰胺(Asn)最低，為-3.200，親水性最強(圖8A)。VACV IHD-J的G9蛋白中，第334位Trp最高，為3.600，疏水性最強；第55位賴氨酸(Lys)最低，為-2.933，親水性最強(圖8B)。GTPV AV41的G9蛋白從318～335位氨基酸是跨膜區(圖9A)，VACV IHD-J的G9蛋白從322～339位氨基酸是跨膜區(圖9B)。

在GTPV AV41的A16蛋白中，第351位半胱氨酸(Cys)和第352位亮氨酸(Leu)最高，為3.411，疏水性最強；第275位精氨酸(Arg)最低，為-2.900，親水性最強(圖8C)。VACV IHD-J的A16蛋白中，第351位纈氨酸(Val)最高，為3.156，疏水性最強；第275位精氨酸(Arg)最低，為-2.867，親水性最強(圖8D)。GTPV AV41的A16蛋白從342～361位氨基酸是跨膜區(圖9C)，VACV IHD-J的A16蛋白從341～363位氨基酸是跨膜區(圖9D)。

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

A.GTPV AV41的G9蛋白；B.VACV IHD-J的G9蛋白；C.GTPV AV41的A16蛋白；D.VACV IHD-J的A16蛋白

2.10 半胱氨酸殘基位點及豆蔻酰化位點比對

通過EMBOSS Needle網站對比GTPV AV41和VACV IHD-J G9、A16蛋白序列中的半胱氨酸殘基位點。由比對結果可知，GTPV AV41 G9共15個半胱氨酸殘基位點，VACV IHD-J G9共14個半胱氨酸殘基位點(圖10A，黃色)；GTPV AV41 A16共21個半胱氨酸殘基位點，VACV IHD-J A16共20個半胱氨酸殘基位點(圖10B，黃色)。GTPV AV41與VACV IHD-J G9、A16蛋白各有一個豆蔻酰化位點(圖10,紫色)。

圖10 G9(A)、A16(B)蛋白半胱氨酸殘基位點比對結果

2.11 三級結構

通過Phyre2網站使用同源建模方法分析GTPV AV41 G9、A16蛋白的三級結構。結果顯示，G9蛋白第39～88位氨基酸序列形成類似于甲烷球菌產生的精氨酸脫羧ase2突變體結構，具有裂解酶的相似功能；第317～334位氨基酸序列形成類似于小鼠的fas/cd95細胞死亡受體跨膜結構域，具有細胞凋亡和跨膜功能。A16蛋白第50～107位氨基酸序列具有鏈霉菌2419-svt2蛋白的晶體結構(apo2型)，是用于生物合成的一種蛋白質；第347～361位氨基酸序列具有新穎的跨膜螺旋結構，可以形成跨膜蛋白。

3 討論

本研究通過克隆山羊痘病毒弱毒苗毒株GTPV AV41的G9、A16基因序列并進行測序，將測序得到的G9、A16核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，利用生物信息學軟件和在線分析網站將VACV IHD-J以及其他痘病毒的同源序列與GTPV AV41的G9、A16序列進行比對并構建分子進化樹，對G9、A16蛋白進行理化性質和生物信息學分析。結果顯示GTPV AV41與VACV IHD-J的G9、A16核苷酸序列以及氨基酸序列的一致性很低且親緣關系較遠。GTPV AV41的G9蛋白是堿性的性質穩定的蛋白，A16蛋白是堿性的性質不穩定的蛋白。在G9蛋白中有23個絲氨酸磷酸化位點，5個蘇氨酸磷酸化位點，在A16蛋白中有18個絲氨酸磷酸化位點，9個蘇氨酸磷酸化位點，這些磷酸化位點可以促進該蛋白和其他蛋白相互作用，從而形成多蛋白聚合體，為G9、A16形成二聚體提供了依據[16]；G9蛋白中的6個酪氨酸磷酸化位點和A16蛋白中的9個酪氨酸磷酸化位點可以影響宿主細胞的信號轉導機制，從而控制宿主細胞生長[17]，這些磷酸化位點的識別對于研究蛋白質功能有重要作用。G9和A16蛋白的二級結構中以無規則卷曲和α-螺旋為主。α-螺旋有利于蛋白質結構的穩定，無規則卷曲為凸出結構，大多出現在蛋白質表面，有利于形成表位。將G9和A16蛋白二級結構和抗原表位的預測結果綜合分析發現，G9蛋白的7～21、139～145、209～214、236～250位氨基酸，A16蛋白的43～57、236～244、249～254位氨基酸存在形成表位的潛力，可以作為優勢抗原表位，為以后的疫苗制備提供依據。G9和A16蛋白的氨基酸序列末端疏水性較強，可以形成跨膜區域，而且在三級結構預測中有跨膜構象，這對病毒吸附、侵染等過程發揮重要作用[18]。半胱氨酸是蛋白質中唯一一個可以形成二硫鍵的氨基酸，使蛋白質折疊成穩定的三級結構甚至是四級結構，G9蛋白有15個半胱氨酸殘基位點，A16蛋白有21個半胱氨酸殘基位點，這為病毒蛋白形成功能構象提供基礎；G9和A16蛋白的N-端還有一個豆蔻酰化位點，這與病毒的復制組裝有關[19]。

由于山羊痘病毒G9、A16蛋白的功能是從痘苗病毒的研究成果中推斷而來，所以把2個病毒的G9、A16蛋白進行了相應的比較。從氨基酸的個數上來說，GTPV與VACV的A16蛋白氨基酸數量完全相同，GTPV比VACV的G9蛋白少了4個氨基酸，但兩者對應蛋白的氨基酸序列有著很大的差異。在蛋白的磷酸化位點和抗原表位的預測結果中發現GTPV AV41與VACV IHD-J的G9、A16蛋白在位點和個數上有很大的不同，但有趣的是，在二者的G9、A16蛋白二級結構和保守結構域的預測結果中無論是在氨基酸折疊類型所占比例和位置，還是保守結構域的個數，以及構成結構域的氨基酸的個數都非常的相似。再進一步對GTPV AV41和VACV的G9、A16蛋白疏水性和跨膜區進行對比分析，結果GTPV AV41的G9、A16蛋白與Wagenaar等[20]發現的VACV的G9、A16蛋白跨膜區結果一致。在半胱氨酸殘基位點的比對中發現，雖然GTPV AV41與VACV IHD-J的G9、A16蛋白序列差異很大，但在半胱氨酸殘基線性位點上除了GTPV AV41的G9序列第190位半胱氨酸和GTPV AV41的A16序列第351位半胱氨酸與VACV IHD-J不同之外，其他位點上的半胱氨酸和N-端的豆蔻酰化位點都能一一對應，說明蛋白之間的三級構象以及作用位點非常相似。

綜上，本研究對GTPV AV41的G9、A16基因進行克隆，并對其序列進行一系列生物信息學分析，為進一步研究G9、A16蛋白提供了基本數據資料。同時，將其與VACV同源基因比較，雖然GTPV和VACV的G9、A16蛋白在氨基酸序列上存在很大差異，但兩者具有相對保守的結構域，蛋白跨膜區、半胱氨酸殘基位點等高級結構也高度相似。因此，山羊痘病毒G9、A16蛋白功能的進一步研究可以參考痘苗病毒的相關研究結果。